基于核苷酸结合的寡聚结构域1/受体相互作用蛋白2通路探讨N-乙酰-5-羟色胺调控大鼠视网膜缺血再灌注后小胶质细胞极化的机制

目的观察N-乙酰-5-羟色胺(NAS)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)后视网膜小胶质细胞极化的影响,并基于核苷酸结合的寡聚结构域1(NOD1)/受体相互作用蛋白2(Rip2)通路初步探讨其机制。方法采用随机数字表法将60只雄性Sprague Dawley大鼠分为假手术组(Sham组)、RIRI组、NAS组,分别为21、21、18只,以右眼为实验眼。RIRI组、NAS组大鼠采用前房高眼压法建立RIRI模型。NAS组大鼠分别于建模前及建模后30 min腹腔注射10 mg/kg NAS。建模后24 h,苏木素-伊红、免疫组织化学染色观察各组大鼠视网膜形态学变化,计数视网膜神经节细胞(RGC);免疫荧光染色观察NAS干预对大鼠视网膜小胶质细胞极化的影响。转录组测序筛选Sham组、RIRI组间差异基因,蛋白质免疫印迹法(Western blot)、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)进行验证。免疫组织化学染色、Western blot、RT-PCR观察NAS对大鼠视网膜组织及小胶质细胞中NOD1、Rip2蛋白、mRNA表达的影响。一般线性回归分析NAS组、RIRI组大鼠视网膜组织中NOD1+细胞数差值与M1、M2型小胶质细胞数差值的相关性。结果Sham组大鼠视网膜可见大量RGC;建模后24 h,与Sham组比较,RIRI组大鼠视网膜内层厚度显著增加、RGC数量显著减少;NAS组大鼠视网膜内层厚度显著变薄,RGC数量显著增多。与Sham组比较,RIRI组大鼠视网膜M1、M2型小胶质细胞数显著增多;与RIRI组比较,NAS组大鼠视网膜M1型小胶质细胞数显著减少,M2型小胶质细胞显著增多。三组大鼠视网膜M1、M2型小胶质细胞数比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。转录组测序结果显示,建模后24 h,视网膜NOD1、Rip2为重要差异基因;RIRI组视网膜中NOD1、Rip2 mRNA、蛋白相对表达量显著高于Sham组,差异均有统计学意义(P<0.05)。RIRI组视网膜小胶质细胞中NOD1+、Rip2+细胞数及mRNA、蛋白相对表达量显著高于Sham组,NAS组亦较Sham组显著升高,但低于RIRI组,差异均有统计学意义(P<0.05)。RIRI组视网膜小胶质细胞中离子钙接头蛋白1(Iba-1)+/NOD1+及Iba-1+/Rip2+细胞数较Sham组显著增多,NAS组较RIRI组显著减少,但仍显著多于Sham组,差异均有统计学意义(P<0.05)。相关性分析结果显示,NAS组、RIRI组视网膜NOD1+、Rip2+细胞数差值与M1型小胶质细胞数差值呈正相关(r=0.851、0.895),与M2型小胶质细胞数差值呈负相关(r=-0.797、-0.819),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NAS可促进RIRI大鼠视网膜小胶质细胞M2型极化,抑制M1型极化,其机制与NOD1/Rip2通路有关。