BHK-21细胞库的建立及其生物学特性鉴定

从美国典型培养物保藏中心(ATCC)和中国兽医药品监察所(中监所)引进2株BHK-21细胞系,传代扩增培养后液氮冻存,建立相应的细胞库;复苏细胞后对活力、形态、生长曲线、微生物污染、染色体核型及荧光蛋白质粒转染表达等特性进行研究。结果显示,2个来源的BHK-21细胞系均呈成纤维型,生长状态良好;生长曲线呈S型;细菌、真菌、支原体及外源病毒检查均为阴性;染色体为21对,二倍体均占主体;外源质粒在该2株细胞系中能进行复制和表达。这可为开展BHK-21细胞系及口蹄疫疫苗的研究与开发提供基础理论依据和细胞资源。

悬浮培养型BHK-21细胞的生长规律和不同接种密度培养效果的研究

为探索悬浮培养型BHK-21细胞的生长规律和最佳接种密度,以3.0×105个/mL、4.0×105个/mL、5.0×105个/mL、6.0×105个/mL和7.0×105个/mL等5个接种密度培养了悬浮培养型BHK-21细胞,绘制了细胞生长曲线和活力变化曲线.结果显示,悬浮培养型BHK-21细胞生长曲线呈"S"型,接种培养前24 h细胞处于适应期,生长曲线上密度增长不大,期后细胞进入对数增长期,生长密度呈指数增长.以3.0×105个/mL和4.0×105个/mL接种培养的在120 h达到最大增殖密度,分别为4.65×106个/mL和5.59×106个/mL,倍增时间分别为26.9 h和26.7 h;以5.0×105个/mL、6.0×105个/mL和7.0×105个/mL接种培养的在96 h就达到最大增殖密度,分别为5.14×106个/mL、5.36×106个/mL和5.1×106个/mL,倍增时间分别为22.4 h、24.1 h和25.2 h.各组在培养的96 h以前细胞活力均在90%以上且变化较小,120 h和144 h时细胞活力开始下降,且接种密度越高活力下降越快.该细胞以4.0×105个/mL、5.0×105个/mL、6.0×105个/mL接种培养能达到较高培养密度,细胞生长快,且细胞峰值持续时间长.

静置培养BHK-21细胞生长及代谢动力学研究

为研究BHK-21细胞的生长及代谢动力学特征,试验采用低密度静置培养方法,每天测定细胞生长密度和活力,并利用多参数生化分析仪测定培养液中Gluc、Lac、Gln和NH4+的含量,计算细胞指数生长期的比代谢速率。结果表明:BHK-21细胞生长曲线呈S型,最大增殖密度为50.3×104 upf·mL-1,倍增时间为21.1h;对数生长期Gluc和Gln的比消耗速率为-3.79mg·(106 cells)-1·d-1和-9.95μmol·(106 cells)-1·d-1,Lac和NH4+的比生成速率为2.81mg·(106 cells)-1·d-1和6.30μmol·(106 cells)-1·d-1。

无血清培养基悬浮培养BHK21细胞驯化的研究

本研究主要探索用常规BHK21贴壁细胞(F38)驯化为适应无血清培养基的全悬浮细胞的过程并使用生物反应器放大进行了相关研究。实验表明:常规BHK21细胞通过运用相应的商品化培养基进行低血清贴壁驯化、再到低血清全悬浮驯化、最后到无血清全悬浮驯化,使细胞达到全悬浮的状态。经过四十代的传代后,细胞在无血清悬浮培养基中生长细胞数量可达3.0×106/mL以上,且形态较好,倍增时间稳定,活力在90%以上。实验中采用速降和缓降两种方法进行过渡驯化,结果表明,在贴壁状态下,细胞对缓降方式比速降方式适应性要好,细胞的形态较好,活力在90%以上。细胞从低血清悬浮到无血清悬浮过程中,两种过渡方式无明显差异,均经过了5～10代驯化,细胞就完全适应了无血清悬浮培养基。无血清悬浮细胞从液氮中复苏后,采用直线放大的形式从1.5 mL到250 mL再到5 L反应器最后到650 L反应器中生长。在培养参数方面进行了摸索,最终验证用直线放大的方法是可行的。细胞数量可达4.5×106/mL左右,细胞活力在90%以上,且细胞在放大过程中,形态良好,倍增时间稳定在18 h。

冷藏保存BHK21细胞悬液及复苏试验

采用方瓶存放BHK21细胞悬液，在2℃～8℃冰箱存放不同时间后，按常规方法进行细胞复苏和传代。对比存放不同时间后细胞复苏时的驯化次数、细胞数量和细胞活力，寻求最佳存放时间和复苏代次以指导生产。同时将2℃～8℃冷藏保存方法与液氮冻存细胞方法在细胞复苏周期和达到所需扩繁细胞数方面进行比较。结果表明，方瓶冷藏保存BHK21细胞悬液最长可存放60d，经2—5代驯化后，细胞形态和活力恢复正常，细胞数量与收悬液前细胞数量无显著差异，并能稳定传20代以上。与液氮冻存细胞方法相比，该方法在快速恢复细胞产量时有较大优势，在生产周期紧张的情况下可作为辅助方法保障细胞传代的延续。

口蹄疫病毒的研究进展

口蹄疫是发生在动物体内的一种顽固的急性、热性、高度接触性传染病，口蹄病毒群体庞大、复制突变率，是导致口蹄疫发生的根源所在。文章对口蹄疫病毒的基因组结构、致病毒力及免疫学研究进展等方面展开综述，为今后科学有效地预防口蹄疫提供理论依据。

管道化培养与常规转瓶培养BHK21细胞的比较与分析

本试验在常规转瓶培养BHK21细胞的基础上,推出管道化培养BHK21细胞,旨在控制污染,提升产品质量。通过此工艺的革新,在降低细胞污染率和淘汰率、提高产品质量、提高工作效率和产能、降低劳动强度等方面均起到了很大的作用。给大规模动物细胞培养提供了可靠的保障。