温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响

对重组大肠杆菌 (E.coli) BL2 1 (DE3 )发酵生产 rh Cu/ Zn-SOD的诱导温度进行了优化 ,考察了 3 7°C和 3 0°C下重组菌的生长规律及产物表达。在 5 L自控发酵罐中的发酵结果表明 :较低温度时菌体的比生长速率较低 ,菌体活性与质粒稳定性有很大程度的改善 ,外源蛋白稳定性与可溶性也有一定的提高 ;3 0°C诱导时 rh Cu/ Zn-SOD的酶活性最高 ,每毫升发酵液的酶活力为 475 7U,约为 3 7°C诱导时的 2 .

豆油对红霉素生物合成的影响及作用机制分析

在摇瓶培养过程中,培养基中加入豆油可使红霉素的效价从3038U/mL(不加豆油)提高到5221U/mL。但对丙酰辅酶A合成酶及红霉素链霉菌H18丙酸激酶的比活力无显著影响。使用HPLC检测发酵液中α-酮戊二酸(α-KG)的含量,结果发现加豆油后α-KG含量有明显提高。据此推测了豆油经过红霉素链霉菌H18代谢后进入红霉素合成的可能途径是:通过三羧酸循环代谢产生琥珀酰辅酶A,琥珀酰辅酶A异构化产生2-甲基丙二酰辅酶A,2-甲基丙二酰辅酶A作为红霉素的前体最终促进红霉素的合成。

乳糖诱导重组人SOD基因在大肠杆菌中的表达

利用乳糖代替 IPTG诱导 rh Cu/ Zn- SOD在大肠杆菌 (Escherichia coli) BL2 1(DE3)中的表达 ,并将菌体生长情况及产物表达规律与 IPTG诱导进行比较。对诱导所需的乳糖浓度、金属离子浓度等因素进行了研究 ,并分析了低温下诱导对重组蛋白表达的影响。最终在摇瓶发酵条件的基础上 ,实现了乳糖诱导重组菌的 5 L 全自动发酵罐培养 ,rh Cu/ Zn- SOD酶活性达到 1810 U/ ml(发酵液 )。结果表明 ,乳糖可以诱导 rh Cu/ Zn- SOD在 Escherichia coli中的表达 ,并且酶活性达到 IPTG诱导时的 89%。

1,3-丙二醇发酵过程中盐浓度的胁迫作用

通过对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)甘油发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)过程的研究发现,盐浓度对1,3-PD发酵有胁迫作用。盐浓度较低时,菌体生长和产物生成均维持较高速率;盐浓度较高时会导致菌体生长减慢,1,3-PD最终浓度,甘油到1,3-丙二醇的转化率降低,同时1,3-丙二醇氧化还原酶受到抑制。在5m3罐中控制合适的盐浓度可以提高1,3-PD的发酵水平,使1,3-PD的最终浓度达到64g/L,转化率61%,生产强度2.1g/(L·h)。

重组人Cu·Zn-SOD工程菌发酵工艺的研究

人Cu·Zn SOD是一种重要的氧自由基清除剂 ,传统工艺是从动物血中提取得到 ,受原料来源的限制。从人胎肝中提取了hCu·Zn SODcDNA构建了基因工程菌 ,同时对其表达产物的条件进行研究 ,着重探索了接种量、接种时机、pH、溶氧等因素 ,并优化了发酵条件。通过在 5L全自动发酵罐上研究重组菌BL2 1的培养条件 ,确定了最适条件为 :接种量 2 % ,溶氧水平≥ 40 % ,初始 pH6 5 ,培养过程中用 3mol/LHCl调节 pH在 7 5。在此条件下 ,发酵最高水平达到酶活95 0U/ml,比活 14 0 0U/mg。

控制氮源浓度提高1,3-丙二醇的发酵水平

通过对克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)甘油发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD)发酵过程的研究发现,氮源浓度对菌体生长、产物和副产物的代谢有着重要影响。氮源浓度较低时,菌体生长和产物生成都会因氮源不足受到影响;氮源浓度较高时会导致菌体过度生长和副产物的大量生成,降低1,3-PD的最终浓度和甘油到1,3-丙二醇的转化率。控制合适的氮源浓度可以提高1,3-PD的发酵水平,1,3-PD的最终浓度达到61.20 g.L-1、甘油到1,3-丙二醇的转化率达到0.72(mol.mol-1),分别比对照提高了10%和20%。

以脂肪酶活为指标快速筛选红霉素摇瓶发酵培养基

筛选红霉素链霉菌的摇瓶培养基需要将红霉素链霉菌在摇瓶中培养 6 d,然后测定红霉素链霉菌的效价 ,使用该方法需要至少 6 d的时间。而测定红霉素链霉菌在摇瓶中 d1脂肪酶的活力 ,并与对照样品比较 ,则只使用 1d的时间就能够推测红霉素链霉菌在 6 d后的效价 ,使用这一新方法 ,我们快速筛选出红霉素链霉菌 d1的酶活力比对照培养基高的两组新培养基 ,并且确认了新培养基中 6 d后的最高效价为 9313μg/ ml,比对照培养基提高了 78.38%。

添加物对D-核糖生物合成的影响

采用枯草杆菌D2 0 1转酮醇酶缺陷型突变株 ,研究菌种生长与D 核糖合成优化工艺。在培养剂中添加山梨醇、KH2 PO4和芳香族氨基酸 ,发现对菌的生长有刺激作用 ,特别是山梨醇 ,它可缩短延迟期 ,促进菌的生长。此外 ,用葡萄糖酸钙部分代替葡萄糖能增加D 核糖的产量 ,用葡萄糖和葡萄糖酸的混合碳源发酵 ,D 核糖产量可达到 5 2 g/l。

培养基中无机盐对红霉素A含量的影响

红色糖多孢菌在含不同有机氮源的培养基中发酵生产红霉素时,红霉素效价和含量明显不同。对不同有机氮源培养基中无机盐含量进行聚类分析,结果发现,锌对红霉素A含量有明显影响,并对此进行了验证实验。

有机氮源对红霉素发酵影响的具体分析

红色糖多孢菌的摇瓶培养基中使用不同有机氮源时红霉素的效价明显不同。通过对不同有机氮源所含营养成分的逐步回归分析,我们得到有机氮源中的苏氨酸为影响红霉素效价的主要因子。最后向对照培养基中添加苏氨酸,则使红霉素的效价比对照培养基提高了22.85%。

Red重组系统在克雷伯氏肺炎杆菌中的应用研究

通过改造pKD46与pCP20质粒为含四环素抗性标记的pKD46-Tc与pCP20-Tc重组质粒,初步建立了一套能在K.pneumoniae菌株中运用的Red重组系统。以荚膜基因中的高保守基因wzi为敲除对象,导入同源臂为250 bp的打靶片段△wzi::FK,转化后得到6个重组子,初步确定敲除了K.pneumoniae菌株的荚膜基因wzi。

发酵工程实验教学改革探索与实践

华东理工大学国家精品课程发酵工程课程建立了"基础、综合、创新"三个层次的发酵工程实验体系。在多年的发酵工程实验教学中,我们形成了导向明确的实验设计、多层面互动的教学方法、多角度的综合评价体系和功能实用的实验教学辅助手段。本文从一线教学实践的角度予以总结,详述了发酵工程实验教学改革的具体措施和经验体会。

粗糙集在红霉素培养基优化中的应用

红色糖多孢菌的摇瓶培养基中采用不同有机氮源时红霉素的效价明显不同。通过粗糙集理论的EDMAR属性约简算法结合聚类分析,确定钾、铜、钴是影响红霉素效价的主要因素。培养基中添加钾和钴分别提高效价约14%和10%,添加铜会抑制红霉素的生物合成。该法能迅速、准确地确定有机氮源中的关键营养因子,对氮源的选择和发酵结果的稳定有重要的意义。

RP-HPLC测定黄豆饼粉中的B族维生素

建立了黄豆饼粉中B族维生素的RP-HPLC测定方法：采用C1 8柱,流动相为甲醇∶水（含5 mmol.L^-1PIC-B6和1%冰醋酸,三乙胺调pH值3.2）=30∶70,检测波长为2 7 5 nm,苯甲酸为内标物,VB1、VB2、VB6和VB1 1的平均回收率为99.35%-100.03%、RSD为0.42%-1.08%。本方法同时测定4种维生素,具有快速、简便、准确的特点。

D-乳酸合成阻断对肺炎克雷伯氏菌的1,3-丙二醇发酵的影响

利用Red同源重组技术,快速敲除肺炎克雷伯氏菌中的编码D-乳酸脱氢酶的两个基因——ldhA和dld,获得KG1-1和KG1-2两个突变株,并研究了敲除编码D-乳酸脱氢酶基因丧失合成D-乳酸的KG1-1菌株的1,3-PD产量和菌体生长变化,实验结果表明乳酸合成缺失对现有工艺1,3-丙二醇发酵无影响。

1,3-丙二醇发酵中氧化还原电位的变化与控制

引入氧化还原电位(ORP)作为参数,研究了克雷伯氏肺炎杆菌发酵产生1,3-丙二醇的工艺,结果发现氧化还原电位的水平与克雷伯氏菌的代谢过程密切相关,ORP维持较低水平的时间越长,菌体的快速生长期和1,3-丙二醇的快速合成期也越长,而且在1,3-丙二醇的快速合成期其合成速度和ORP水平有明显的相关性。研究了NaH2PO4对发酵过程的影响,结果发现较低浓度的NaH2PO4能够降低ORP的水平,较高浓度的NaH2PO4能够延长ORP的相对稳定期。因此,通过控制磷源的补加及调控氧化还原电位的变化,可显著提高1,3-丙二醇的最终浓度和甘油转化率。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶的可溶性表达

系统考察了pET可溶性表达系统对酵母来源的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表达情况,结果显示:当采用含Nus.Tag融合标签的pET-44a为载体,trxB和gor双突变的Ori-gami为宿主时最适合目的蛋白的可溶性表达。进一步考察不同来源(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌)SAM合成酶的可溶性时,也得到了相似的结论;比较发现酵母来源的SAM合成酶可溶性表达的比活力最高达60.9U/mg。

RP-HPLC测定作为红霉素发酵生产氮源的黄豆饼粉中的B族维生素

建立了黄豆饼粉中B族维生素的RP-HPLC测定方法,采用C18柱,流动相为甲醇:水(30:70,水相含5mmol/L的PIC-B6,冰醋酸1%,三乙胺调pH),检测波长为275nm,苯甲酸为内标物,4种维生素(Vb1、Vb2、Vb6、叶酸)的平均回收率在99.35%-100.03%;RSD在0.42%-1.08%。本方法同时测定四种维生素具有快速、简便、准确的特点[1]。

腺苷发酵液中有机酸的代谢规律

选取了优化过程中典型的3种含有不同碳源的培养基配方(其中配方A中含有100g/L葡萄糖,配方B中含100g/L蔗糖,配方C中含100g/L蔗糖和10g/L谷氨酸),进行摇瓶发酵生产腺苷(AR),以测定发酵液的生化参数。通过研究发酵液中的有机酸与腺苷的积累在时序性上的代谢规律,在此基础上提出了通过增强TCA循环为手段以提高目的产物产量的观点,即TCA强化论假说。

两阶段控制甘油浓度提高1,3-丙二醇发酵水平

克雷伯氏菌(K lebsiella pneum on iae)分批发酵生产1,3-丙二醇(1,3-PD),根据菌体生长、产物生成和补料可将发酵过程分成4个阶段。不同阶段控制不同的底物浓度会对菌体生长和产物生成产生不同的影响。研究发现,菌体生长阶段(阶段II)底物浓度控制在6.0 g/L最适合菌体生长,产物主要生成阶段(阶段III)底物浓度控制在18.9 g/L最适合产物生成,菌浓可达7.83 g/L,最终1,3-PD的浓度为68.5 g/L,摩尔转化率为61%,生产强度为2.21 g/(L.h)。