复合菌株发酵猪血粉的条件研究

利用筛选出的 2株高产蛋白酶的米曲霉 (Aspergillusoryzae)菌株AS1 0 0、AS1 0 2作猪血粉发酵的主发酵菌株 ,配以 1株酵母菌 (Saccharomycescerevisiae)菌株Y1 1 3和 1株细菌(Bacillussp )菌株Asp0 0 7为辅助菌株 ,研究了这四株菌的产酶性能 ,同时确定了它们在发酵血粉过程中的一系列参数。通过猪血粉发酵 ,获得了一种高蛋白发酵饲料 ,其香味浓郁 ,蛋白质含量高达 69% ,且富含游离氨基酸 ,VitD3 、烟酸等维生素及Fe等无机元素 。

苏云金芽胞杆菌4.0718菌株中杀虫晶体蛋白基因的定位及鉴定

【目的】对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)4.0718菌株中的杀虫晶体蛋白基因(insecticidal crystal protein gene,简称cry基因)进行定位和鉴定,系统分析高毒力Bt4.0718菌株的杀虫基因背景。【方法】采用脉冲电泳(PFGE)分离Bt4.0718菌株的基因组DNA,确定该菌株的PFGE图谱和质粒图谱;采用Southern杂交分析该菌株中cry基因的定位,并使用PCR及PCR产物限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法鉴定该菌株染色体和质粒上含有的cry基因类型。【结果】确定了Bt4.0718菌株的PFGE图谱和质粒图谱,鉴定到Bt4.0718菌株的染色体和质粒上均定位有cry基因,且分别包含cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab4种基因成分。但染色体上含有的cry基因可能不如质粒上含有的cry基因具有完整的开放阅读框。【结论】首次在Bt4.0718菌株的染色体上发现有丰富的cry基因,且与质粒上含有的cry基因类型一致。

苏云金芽胞杆菌Bt 0601发酵条件的优化研究

应用正交实验和单因子实验,结合杀虫毒力测定,对携带杀虫基因cry1Ac和虎纹捕鸟蛛毒素基因Hwtx-I的苏云金芽胞杆菌工程菌Bt 0601的发酵工艺条件进行研究。实验获得的苏云金芽胞杆菌Bt 0601工程菌的最佳发酵条件为:发酵初始酸碱度控制在pH 7.5、发酵温度(30±0.5)℃、转速200 r/min、通气量为30 mL/300 mL,接种量为4%,培养44 h。此外,本文还对Bt 0601菌株在30 L发酵罐中的发酵特性进行了研究,摸索了通气量对其大罐发酵的影响,确定大罐发酵的最佳通气量为1.75 L/min。

苏云金芽胞杆菌抗癌晶体蛋白的研究进展

抗癌晶体蛋白(parasporins,PS)是由没有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌产生的一种晶体蛋白,在经过蛋白酶酶解后产生的活性多肽对来自人类不同组织的癌细胞具有特异性细胞毒性,而对正常细胞具有较低毒性或不具有毒性,是一种具有很大潜力的微生物抗癌蛋白。就最近几年苏云金芽胞杆菌中已发现的抗癌晶体蛋白的种类、结构特征、细胞活性谱和杀虫机制进行简要概述。

AT1R 1166A/C和CYP11B2-344C/T基因多态性与湖南汉族原发性高血压的相关性

目的探讨血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)1166A/C和醛固酮合酶(CYP11B2)-344T/C基因多态性与原发性高血压(EH)的相关性。方法用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)对100例EH患者和100例体检健康者AT1R1166A/C和CYP11B2-344T/C基因多态性进行检测。结果 EH组AT1R 1166A/C AC型和C等位基因的频率高于健康对照组;AC基因型的血压值、TG,TC,LDL-C均明显高于AA基因型。HDL-C低于AA型CYP11B2各基因型频率和等位基因频率无显著性差异(P>0.05)。各组内等位基因T的频率高于等位基因C(P<0.05)。两基因联合分析显示,相对于AA-TT联合基因型,同时携带AC-CT联合基因型的人群患高血压的危险性增加了2.25倍。结论 AT1R 1166A/C多态性与EH易感性相关,CYP11B2-344T/C基因多态性与EH无关,携带AT1R 1166A C型基因以及AC-CT联合基因型的人群患高血压的危险性大。

降钙素原与C反应蛋白检测在细菌性感染中的临床应用

目的研究血清清降钙素原(PCT)与C反应蛋白(CRP)在细菌性感染疾病中的诊断、病情监测以及预后评估的应用价值。方法将45例细菌感染患者分为重症感染组和局部感染组,检测血清PCT、CRP的含量,并与病毒感染组和健康者进行分析比较。分别采用酶联免疫荧光法检测各组血清PCT水平,采用透射比浊法测定各组血清CRP水平。结果重症细菌细菌感染组与局部细菌感染组血清PCT、CRP水平明显升高,与病毒感染组、对照组比较差异有显著性(P<0.05);与局部感染组比较,重症感染组血清PCT、CRP水平明显升高,差异有显著性(P<0.05)。以PCT>0.5 ng/mL为界,诊断细菌感染的敏感性为86.7%,特异性为90.2%;以CRP>10 mg/L为界,诊断细菌感染的敏感性为71.1%,特异性为85.9%。血清PCT值随病情加重而升高,病情缓解而降低。结论血清PCT、CRP检测在细菌感染的早期诊断中有一定价值,动态监测PCT水平有助于患者的病情监测和预后评估。

发酵血粉菌株的优化选育

从霉变猪血中筛选到产蛋白酶菌株 16株 ,研究了各菌株产复合酶的性能 ,并对其进行组合优化 ,从中筛选出一组兼产蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、羧甲基纤维素酶、植酸酶及果胶酶的优化菌株 ,初步鉴定并命名为米曲霉 (AspergillusOryzae )AS10 0、AS10 2 ,酿酒酵母 (Sac charomycescerevisiae)Y113 ,芽孢杆菌 (Bacillussp .)Asp0 0 7。经血粉发酵试验 ,发酵产品香味浓郁 ,营养丰富 ,蛋白质含量高达 69% ,且富含游离氨基酸和无机元素 ,证实了该组合菌株是发酵血粉的优化菌种。

杀线虫苏云金芽孢杆菌研究进展

简述了近年来对线虫有杀灭活性的苏云金芽孢杆菌(B.t.)及其晶体蛋白的研究进展,主要包括具有杀灭线虫活性的B.t.种类、B.t.所杀线虫的种类、杀线虫晶体蛋白结构特点和作用机理以及有关的专利。讨论了杀线虫基因的克隆、表达和B.t.制剂的应用。展望了B.t.生物杀虫剂在线虫的生物防治中的应用前景。

急性胰腺炎伴肝损伤的临床分析

目的探讨急性胰腺炎(AP)严重程度与肝功能受损指标的相关性,分析AP时肝损伤的发生概率与AP严重程度之间的关系,并探讨不同严重程度的AP患者之间年龄、性别、体重指数是否存在差异。方法通过收集2011年10月至2012年6月长沙医学院附属医院检验科的AP患者72例的临床资料,其中轻度26例、中度31例、重度15例;水肿型52例,坏死型20例。并随机选取25例健康成年人作为对照组。比较轻、中、重度3组与对照组之间年龄、性别、体质量指数的差异和肝功能受损指标ALT或AST的关系以及水肿型、坏死型AP与ALT或AST的关系并进行统计学分析。结果对照组、轻型组、中型组和重型组之间年龄和性别比较差异无统计学意义(P>0.05),但轻型、中型、重型3组体质量指数与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。轻、中、重度3组病例ALT或AST阳性率与健康对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),而在轻、中、重度3组病例ALT或AST阳性率的两两比较中,轻度、中度和重度之间比较差异均有统计学意义(P=0.003,P=0.005),而中度与轻度之间差异无统计学意义(P>0.05)。水肿型与坏死型两组ALT或AST阳性率均高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且水肿型与坏死型两组之间ALT或AST阳性率比较,差异有统计学意义(P=0.0001)。结论肥胖是AP的诱发因素;AP严重程度与胰腺炎伴有肝损害有一定相关性,其损害程度可反映AP严重程度;急性坏死型胰腺炎的肝损害发生率要高于水肿型胰腺炎。

苏云金芽胞杆菌cry1Ac与烟草几丁质酶tchiB双价基因克隆表达及其杀虫增效作用研究

将苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株质粒上的cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchiB基因(去掉信号肽或去信号肽再加肠激酶位点)构建了重组基因。经过双酶切和亚克隆,将带有cry1Ac基因上游启动序列和下游终止序列的重组基因片段克隆至穿梭载体pHT315,分别构建重组质粒pHUAccB6、pHUAccB7,在大肠杆菌中扩增后,将两个重组质粒分别电转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株XBU001中,获得重组菌株HAccB6和HAccB7。经液体双相胞晶分离提取离心后,将晶体和上清液分别进行SDS-PAGE分析,双价基因重组与cry1Ac基因在无晶体突变株中表达量相比较,几丁质酶活性提高5.2倍,双价重组蛋白表达量显著提高,主要产生130kDa蛋白条带。经定量分析:双价重组目的晶体蛋白占总蛋白量的61.38%;Cry1Ac蛋白占总蛋白量的42%。发酵上清液经60%硫酸铵沉淀,显示出一条分子量为18kDa新蛋白条带。经原子力显微镜和电子显微镜观察,表达后的重组蛋白呈菱形或椭原形晶体,其规格约为1.5×3.0μm;经生测分析,重组菌株HAccB6和HAccB7毒力相近,与HAc菌株比较毒力提高4.5倍,对棉铃虫(Helicourpa armigora)具有高效杀虫活性,其3dLC50值分别为9.1μg/mL和11.34μg/mL。研究结果表明,烟草几丁质酶与cry1Ac双价基因重组表达产物具有杀虫增效作用。

苏云金杆菌Bt0601菌株发酵培养基的优化

运用正交试验L18(37)设计对携带杀虫基因cry1Ac和虎纹捕鸟蛛毒素基因hwtx-I的苏云金杆菌工程菌Bt0601的发酵培养基进行了优化研究.试验获得的最佳优化复合培养基配方为(%):玉米粉1.0,黄豆饼粉0.50,酵母膏0.15,蛋白胨0.05,磷酸二氢钾0.75,碳酸钙0.05,硫酸镁0.035.Bt0601在该优化培养基下发酵,48h每mL发酵液产芽孢11.4×109个,伴孢晶体23.0×107个,对3龄小菜蛾(Plutella xylostella)48h的致死率达96.7%.普通发酵培养基下相应的芽孢产量为9.33×109个,伴孢晶体9.57×107个,毒力为68.5%.

新型蛋白酶抑制剂基因hwtx-11在大肠杆菌中的克隆表达及杀虫功能研究

将化学合成的蜘蛛毒素蛋白酶抑制剂基因hwtx-11克隆至载体pGEX4T-1上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.重组菌株在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western blot分析表明,表达的GST-HWTX-11融合蛋白的相对分子量约为33 kD.对重组菌株诱导表达后的产物进行生物活性测定,GST-HWTX-11融合蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exiguaHubner)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)在3d时的LC50分别为86.6μg/mL、119.4μg/mL;其与Cry1Ac对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫毒力也有明显的协同作用.

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体中20-kb DNAs上染色体基因的鉴定

已有的研究表明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)4.0718菌株菱形晶体中含有与原毒素紧密结合的20-kb DNAs,利用PCR-RFLP分析发现在这些20-kb DNAs上含有cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa和cry2Ab基因.本研究利用特异引物从4.0718菌株中20-kb DNAs上分别扩增出带有自身调控序列的cry1Ac和cry2Aa基因,并将其分别电转至Bt无晶体菌株Cry-B中获得重组菌株Cry-B(pHC42)和Cry-B(pHC39).SDS-PAGE和透射电镜分析表明这两种重组菌株能够分别产生由130-kDa的Cry1Ac原毒素形成的菱形晶体以及由65-kDa的Cry2Aa原毒素形成的方形晶体.毒力生测的结果显示,这两种菌株的表达产物对棉铃虫(Helicoverpa armigera)幼虫具有预期的杀虫效果.重组菌株分别形成的两种晶体经不同的缓冲液溶解后能释放出与20-kb DNAs紧密结合的原毒素,同时在20-kb DNAs上均可检测到源于Bt染色体的spo0A和nprA基因片段.

利用生物可降解海藻酸钙微球保护苏云金杆菌晶体与芽胞免受紫外线降解(英文)

采用基于注射挤压器的液滴形成技术制备包裹了苏云金杆菌晶体和芽胞的海藻酸钙凝胶微球。通过调节该装置的活塞重量和空气压力,获得了平均直径为20μm的微球。SDS-PAGE分析与平板菌落涂布实验表明,凝胶微球可有效减少紫外线对苏云金杆菌晶体和芽胞的损伤作用。利用小菜蛾进行的毒力生测发现,凝胶微球可有效防止紫外线引起的晶体和芽胞杀虫毒力的下降。本研究的液滴形成技术也可适用于其它微球包裹过程。

杀虫球孢白僵菌菌株筛选及类枯草杆菌蛋白酶基因的克隆

在水稻叶蝉僵虫中分离出一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana),根据GenBank上球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因序列同源性设计引物,采用RT-PCR法得到一个球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cD-NA片段.利用表达载体pET28 a(+),在大肠杆菌中表达了CDEP2蛋白.

利用ERIC-PCR对苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌进行鉴定的研究

为了探索ERIC-PCR技术在苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的鉴定及分型中的应用价值,本研究采用PCR方法初步检测苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的组成,并对苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的总DNA进行ERIC-PCR扩增,分析ERIC-PCR指纹图谱的特点并采用NTSYS2.10软件对其进行聚类。结果显示,各菌株的ERIC指纹图谱表现出不同程度的多态性,但图谱与菌株所含cry基因的类型存在一定的相关性。聚类分析结果显示,含有相同或相近cry基因类型的Bt菌株在进化树上趋向聚为一类,而不含cry基因的蜡状芽胞杆菌趋向于与不含cry基因的Bt菌株聚为一类或单独聚类。若在多种模式菌株的参考下,该方法可用于苏云金芽胞杆菌的初步鉴定和分型。

链霉菌Ahn75菌剂助剂的筛选及对水稻稻瘟病的防效研究

为了研制一种高效防治水稻稻瘟病菌剂,本文以水稻稻瘟病病原菌高效拮抗内生菌株灰褐色链霉菌Ahn75为研究对象,分析了不同助剂,包括营养物质、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和稳定剂等对孢子萌发和菌剂稳定性能的影响,并探讨了优良助剂协同生防菌株对水稻稻瘟病的防效。结果发现,叶面肥、酵母提取物、吐温80和糊精均能显著促进链霉菌Ahn75孢子的萌发,且糊精还可一定程度保护Ahn75孢子免受紫外线伤害,而稳定剂海藻酸钠对链霉菌Ahn75孢子萌发影响最小,且表现出比其他稳定剂更好的稳定性能。室外盆栽试验显示,各助剂与Ahn75孢子悬浮液复配均能显著降低水稻叶瘟的发病率和病情指数,其中混合助剂的协同防效最佳,叶瘟防效达38.06%。结合室内和室外试验结果,最终确定菌剂的最佳配方为:孢子含量1×10^(8) CFU/mL、营养物质酵母提取物的质量分数0.05%、润湿分散剂吐温800.05%、紫外保护剂糊精1.00%、稳定剂海藻酸钠0.15%。该研究为生防链霉菌Ahn75菌株的田间应用提供了重要的理论依据和支撑。

1株番茄青枯病内生拮抗细菌的分离鉴定及盆栽防效

从番茄植株分离得到内生细菌18株,其中2株对番茄青枯病病原菌(Ralstonia solanacearum)有较强的拮抗作用,菌株QGJ–6的拮抗圈直径最大,为20.2 mm,盆栽试验中对番茄青枯病的生防效果达82.4%。逐步诱导拮抗内生细菌QGJ–6对硫酸链霉素产生抗性,通过灌根接种的方法,验证了菌株QGJ–6能在番茄的根、茎、叶中定殖。基于菌株QGJ–6的形态特征、生理生化特征以及16S r DNA序列分析结果,将其鉴定为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。

来源于中药的稻瘟病菌拮抗解淀粉芽胞杆菌鉴定及其活性成分特性

为寻找新的水稻稻瘟病拮抗微生物资源,本研究从中药提取液中分离纯化到一株性能优良的拮抗细菌CWJ2。平板对峙试验显示该菌株对水稻稻瘟病菌丝生长抑制率为69.51%。根据菌落、菌株形态、16S r DNA和gyr B基因序列,鉴定该菌株为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。该菌株发酵滤液能明显抑制稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发,10%的发酵滤液能100%抑制菌丝生长;2%的发酵滤液能导致菌丝分支明显减少,菌丝变短、膨大或畸变。菌株CWJ2的发酵液在高温、蛋白酶K、紫外和酸碱处理下,抑菌活性无显著变化。试验结果表明,菌株CWJ2对稻瘟病菌拮抗效果好,且抗菌活性成分稳定,有望作为生防菌株开发防治稻瘟病制剂。

1株高效解钾菌的分离、鉴定及培养条件优化

为获得高效的解钾菌株,从长沙县油菜田土壤中分离有较强解钾能力的菌株,结合菌落形态和生理生化特性及16SrDNA序列分析鉴定菌株,通过单因子试验与正交试验对解钾能力最强的菌株发酵条件进行优化。结果表明:解钾能力最强菌株JK-3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其发酵上清液中有效钾含量较对照增加13.7 mg/L。最优培养基为4.0%葡萄糖、0.1%蛋白胨、1.0%鱼粉、0.5%MgSO4·7H2O;最优培养条件为培养温度28℃、培养时间36h、初始pH 7.2、转速180r/min、接种量2.0%,500mL三角瓶装液量为40mL。