生米卡链霉菌麦迪霉素抗性基因的克隆

应用碱性裂解法提取质粒载体pIJ61和pIJ702,并通过氯化铯—溴化乙锭密度梯度离心纯化,得到了较好的结果。对TK64、TK24、TK23和JI1326四个受体菌作麦迪霉素抗性基因克隆,结果只有TK24对麦迪霉素敏感。 用Bam HI酶切质粒pIJ702,并通过碱性磷酸酶去除磷酸根。生米卡链霉菌的"total"DNA用MboI部分酶切,得到1～8kb大小的DNA片段,1μgBam H1酶切pIJ702DNA和5μgMbo1部分酶切的染色体DNA片段通过T4-DNA连接酶连接,转化变铅青链霉菌TK24原生质体,在R_2YE平板上再生,经过硫链丝菌素和麦迪霉素筛选,得到8个抗性转化子,进一步复证发现pIJ702-5的抗性最强,pIJ702-7的抗性最弱,并且它们在基本培养基上产生的色素也不同。 提取抗性转化子重组质粒,通过再转化实验进一步证实在杂合质粒上确实含有麦迪霉素的抗性基因。将重组质粒转化麦迪霉素产生菌—生米卡链霉菌63的原生质体,经过再生、筛选、得到9个转化子。对转化子进行发酵实验,发现它们的发酵效价与原始菌株相比,有明显的变化。