一种可满足产业化需求的靶向EpCAM嵌合抗原受体慢病毒生产工艺

目的建立一种可满足产业化需求的靶向上皮细胞粘附分子(EpCAM)嵌合抗原受体(CAR)慢病毒生产工艺。方法以EpCAM蛋白为抗原,免疫小鼠获得EpCAM单抗,采用EpCAM单抗的scFv为胞外单链可变区,构建人源化靶向EpCAM的第三代CAR载体质粒,并通过EpCAM CAR载体质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK 293T细胞获得慢病毒粗毒液,粗毒液经核酸酶孵育、过滤澄清、Core 700层析、浓缩换液、除菌过滤、制剂分装等工序获得EpCAM慢病毒成品。结果通过EpCAM单抗成功构建了靶向EpCAM抗原的嵌合抗原受体Humanized EpCAM ScFv-CD28-CD3ζ-CAR,并通过该EpCAM CAR进行2 L悬浮体系慢病毒包装所收获粗毒液,经层析及超滤浓缩等纯化工艺收获慢病毒成品100 mL,成品慢病毒转导滴度达2.16×10^(8)TU/mL,慢病毒总量达2.16×10^(10)TU。成功开发了可满足产业化需求的靶向EpCAM CAR慢病毒上游包装及下游纯化生产工艺。结论具有成本效益的慢病毒(LV)载体制备对于满足产业化需求至关重要,本研究在EpCAM蛋白、EpCAM抗体、及EpCAM CAR载体质粒的基础上,结合完整的慢病毒悬浮生产工艺,制备高滴度高纯度的靶向EpCAM嵌合抗原受体慢病毒,为EpCAM CAR-T细胞治疗实体瘤应用及其产业化奠定基础。

阪崎肠杆菌单克隆抗体的制备及其免疫检测

目的:制备食源性阪崎肠杆菌高纯度、高特异性单克隆抗体并建立其双抗夹心ELISA免疫检测体系。方法:鉴定阪崎肠杆菌后培养集菌获得免疫原,4次免疫BALB/c小鼠后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞1∶3融合,进行杂交瘤细胞阳性筛选及克隆,制备单克隆抗体后采用辛酸-饱和硫酸铵胺法纯化,纯化后的抗体进行配对及亚型鉴定,并使用棋盘滴定法建立快速检测的双抗夹心ELISA免疫方法。结果:经过阳性克隆筛选以及有限稀释法克隆3次后获得了4株分泌抗阪崎肠杆菌单抗的杂交瘤细胞株2A2、4A9、5A3和6A6,其抗体效价均达1.0×10^(5),选择IgG型的6A6作为酶标二抗,2A2作为包被抗体,捕捉抗体的最佳包被质量浓度为2.50μg·mL^(-1),检测抗体的最佳稀释质量浓度为1.25μg·mL^(-1)。成功建立了双抗夹心ELISA检测方法,目标菌纯培养条件下其检测限达1.0×103 CFU·mL^(-1),且与其他数种食源性致病菌无交叉效应。结论:本研究制备的阪崎克罗诺杆菌单克隆抗体效价高、纯度优异,同时建立了一种简便、实用的双抗夹心ELISA免疫方法。