濮67块深层致密凝析气藏开发技术研究

濮城油田濮67块是难动用的深层致密凝析气藏,几年的试采显示气藏开发效果差、采出程度很低。对濮67块天然气储量进行了重新认识和落实,研究了濮67块各砂组剩余天然气的分布规律,明确了该气藏的开发方向,开展了配套的开发技术研究,解决了该气藏的开发难题。通过在生产中应用,取得了较好的增产效果,提高了气藏的采收率。

斑马鱼Slc26A4基因敲除品系的构建

目的SLC26A4是大前庭水管综合征(enlarged ves-tibular aqueduct syndrome,EVAS)的致病基因,也是中国第二位致聋基因。研究发现SLC26A4突变能够导致Pendred综合征(PS),包括甲状腺肿、听力丧失和前庭导水管增大,但其具体的分子机制尚不清楚。为了研究该基因在内耳发育中的具体分子作用机制,本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼Slc26A4基因敲除品系。方法首先通过分析软件筛选出Slc26A4基因的敲除位点,利用PCR技术扩增该基因的sgDNA,再以sgDNA为模板转录得到sgRNA,将sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎中。结果经基因型鉴定,CRISPR/Cas9系统对斑马鱼Slc26A4基因的敲除有效。但基因敲除不影响整体胚胎发育,斑马鱼外观未出现明显畸形。结论使用CRISPR/Cas9系统成功建立了斑马鱼Slc26A4基因敲除突变品系,为研究该基因在内耳发育过程中的作用奠定了基础。

斑马鱼myo7ab基因敲除品系的构建

MYO7A是人类Usher综合征(US)的致病基因。由MYO7A突变导致的Usher综合征病例占Usher综合征1型病例的29%~55%。研究发现人类MYO7A突变能够导致Usher综合征1B型(USH1B),包括感觉神经性听力损伤及年龄依赖性视网膜色素变性(RP),但其分子机制尚不清楚。为了研究该基因在内耳及视网膜发育中的具体分子作用机制,利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建斑马鱼myo7ab基因敲除品系。首先,通过分析软件筛选出该基因的敲除位点,利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增该基因的向导DNA(gDNA),再以gDNA为模板转录得到向导RNA(gRNA),将gRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼1细胞期胚胎中;随后,进行基因编辑的有效性检测。研究结果表明,CRISPR/Cas9系统对该基因的敲除有效。对其进行进一步筛选,成功获得斑马鱼myo7ab基因敲除突变品系,这为研究该基因在内耳及视网膜发育过程中的作用奠定了基础。

斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19~23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。