长期低剂量诱导法培养人体抗砷细胞株的研究

目的培养人体具有抗砷特性的细胞株,为人体抗砷基因研究奠定基础。方法采用人体脐静脉内皮细胞(ECV鄄304),在含有低剂量亚砷酸钠(NaAsO2)的培养基中长期培养,并设同步对照细胞组;利用噻唑兰(MTT)检测法计算细胞生存率及半数致死量(LD50)作为反映细胞对砷耐受性改变的指标。结果短期诱导,细胞未表现出砷耐受性提高,经过12周NaAsO2诱导后,48h急性砷毒性实验中,实验组细胞对急性染砷表现出明显的耐受性提高,实验组在各浓度下生存率都明显高于同步对照组。实验组LD50为14.3μmol/L,对照组LD50为3.9μmol/L。结论人体细胞与其他生物体一样,在长期低剂量砷诱导下可以具备抗砷的特性。

经砷诱导人肝细胞L02获得砷耐受性的研究

砷是自然界普遍存在的毒性较强的类金属元素,几乎所有生物在进化中都产生了对砷毒性的耐受性,生物体对砷的耐受机制受到广泛关注。本实验采用低剂量(4μmol/L)NaAsO2诱导人体正常肝细胞株L02,利用噻唑兰检测法(MTT)计算细胞生存率及半数致死量反映细胞对砷耐受性的改变,结果发现低剂量砷诱导6周后,在48h急性砷中毒试验中,实验组LC50为23.0μmol/L,对照组为11.9μmol/L,实验组明显高于对照组,说明细胞对急性砷中毒耐受性明显提高。

用抑制性差减杂交构建新疆Kaposi肉瘤差异表达基因文库

目的:分离卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)差异表达基因,并建立相应的cDNA文库,为从分子水平揭示KS发病机制打下良好基础.方法:采集KS肉瘤及来源于同一患者的正常皮肤组织,抽提总RNA,逆转录酶合成dscDNA,经Rsa I酶切,与2种不同的接头衔接,分别以正常组织和肿瘤组织作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),初步筛选KS肉瘤与正常皮肤差异表达基因,将差异基因PCR扩增,产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,采用蓝白斑筛选,获得白色阳性克隆菌落,并煮沸破菌,PCR扩增出未知基因片段.结果:差减得到差异基因片段多位于200～500bp,成功构建了2个分别代表在KS肿瘤组织中表达上调和下调的基因文库.结论:经双向抑制性差减杂交获得了KS差异表达基因文库.抑制性差减杂交是一种快速、方便、有效的建立差异基因文库的方法.

Neuritin毕赤酵母表达系统的构建及其对PC12细胞的影响

旨在构建Neuritin的毕赤酵母表达系统获得大量有活性的Neuritin蛋白,研究其神经生物学功能。PCR扩增编码neuritin基因cDNA序列,并纯化回收,通过酶切和连接插入穿梭载体pPIC9K中,转化大肠杆菌DH5α,neuritin-pPIC9k重组质粒经PCR与测序鉴定后,使用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化酵母菌GS115,经筛选与鉴定,成功构建了Neuritin的毕赤酵母表达系统。结果表明,使用甲醇诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析得到11 kD的Neuritin蛋白,纯化的Neuritin蛋白加入PC12细胞培养液中,能促进其突起的生长。

急慢性砷染毒的肝细胞L-02的基因芯片分析

目的用基因芯片分析急慢性砷染毒时人正常肝细胞(L02细胞)基因表达谱的变化。方法6μmol/L的亚砷酸钠染毒L02细胞2,15,24h,4μmol/L的亚酸钠染毒L02细胞2周,分别与未染毒的L02细胞抽提RNA作表达谱基因芯片杂交。结果急性和慢性砷诱导细胞基因表达谱截然不同。染砷后首先激活的是解毒功能相关的基因和一些蛋白质合成相关的基因。长期染砷后与肿瘤发生及氧化还原有关的基因表达量升高。结论细胞短期染砷毒后,应激和解毒功能有关的蛋白表达上调,长期染砷后与肿瘤有关的基因表达上调,急慢性砷刺激下细胞以不同的方式抵抗砷毒。

长期砷诱导L-02细胞的表达谱基因芯片实验

目的 :采用基因芯片技术研究长期砷染毒时人正常肝细胞 (L 0 2细胞 )基因表达谱的变化 .方法 :4 μmol/LNaAsO2染毒人正常肝细胞 (L 0 2细胞 ) 2wk以上与未染毒的L 0 2细胞做表达谱基因芯片杂交 .结果 :长期砷染毒后细胞基因出现多方面表达差异 ,既包括细胞一些正常生理功能如生长发育、分裂增殖相关的基因 ,同时也包含一些与肿瘤发生、发展有关的基因 .结论 :细胞长期暴露于砷环境后多种与肿瘤发生有关的基因差异表达 。

大鼠神经突起因子的克隆及表达载体的构建

从成年SD大鼠脑组织分离提取总RNA,反转录PCR扩增出鼠神经突起因子(neuritin)cDNA的最大开放阅读框(openingreadingframe,ORF)后,重组于克隆载体pGEM3z上,经PCR、限制内切酶鉴定和DNA测序鉴定,扩增出的cDNA426bp全部核苷酸序列与国外文献报道的完全一致;在已构建好的重组克隆载体neuritin pGEM3z基础上,将该neuritinORF亚克隆到原核表达载体pQE30上,为获取具有天然活性的neuritin蛋白及其功能研究提供了基础。

生物体的抗砷基因

砷在自然界分布广泛,主要以砷化物的形式存在,具有较强毒性。生物体在进化的过程中,长期暴露于含砷的环境,从低等生物到高等生物都产生了不同程度的抗砷性,具有相应的基因介导了对抗砷毒的机制。该文介绍抗砷基因及其抗砷机制,并对抗砷基因的研究前景作一展望。

人Neuritin在原核表达系统的构建及表达纯化

Neuritin是一种新发现能促进神经突起和轴突分支的蛋白,为了更清楚的研究它的生物学功能,在已克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF,与原核表达载体pET32a重组后,成功的构建了Neuritin原核表达质粒pET32a-Neuritin。重组质粒转化B121大肠杆菌,IPTG 诱导后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot证实系Neuritin,用镍离子亲和层析的方法获得了纯化的Neuritin蛋白。

Neuritin蛋白的纯化及其对PC12细胞和鸡胚DRG神经元生长的影响

目的:纯化毕赤酵母表达的Neuritin蛋白,通过观察其对PC12细胞和鸡胚背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)的作用,研究其神经生物学功能。方法:采用镍离子金属螯合亲和层析法纯化Neuritin蛋白,Bradford法对纯化的Neuritin蛋白进行定量,然后加入到PC12细胞和DRG的培养液中,通过观察PC12细胞突起的生长情况和细胞形态的变化,研究其促进细胞突起生长的功能;通过观察鸡胚DRG的神经纤维生长情况,研究其促进DRG神经纤维生长活性;通过观察鸡胚背根神经节的裂解时间,研究其阻止细胞退化和凋亡的活性。结果:纯化后的Neuritin蛋白经SDS-PAGE电泳显示,获得11 kDa左右的唯一蛋白条带,即Neuritin蛋白;Bradford定量法计算出其浓度为490μg/ml。纯化的Neuritin蛋白加入到PC12细胞培养液中,PC12细胞长出突起,发生类神经元样改变;鸡胚DRG培养液中加入Neuritin蛋白后,长出神经纤维,裂解时间也延长,并与浓度呈正相关。结论:毕赤酵母表达的Neuritin蛋白得到有效纯化,纯化的Neuritin蛋白能促进细胞突起的生长,阻止细胞的退化和凋亡,延长细胞的存活时间,这为进一步研究neuritin的功能及作用机制奠定了良好的实验基础。

Neuritin在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

目的:构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统,为进一步探讨Neuritin的生物学功能及作用机制奠定基础。方法和结果:在已克隆Neuritin cDNA的基础上,PCR扩增出Neuritin ORF与载体pPIC9k重组,然后利用电击转化将重组质粒pPIC9k-Neuritin导入GS115酵母菌株。筛选出阳性克隆经PCR及测序正确后,用甲醇诱导Neuritin分泌表达;表达产物经SDS-PAGE及Western-blot鉴定。结论:成功构建Neuritin的毕赤酵母分泌表达系统。

构建人类neuritin真核表达系统

目的:构建人类neuritin基因真核表达载体,并观察其转染的PC12细胞中neuritin的表达。方法:用基因重组技术,将人类NeuritincDNA的开放阅读框克隆到真核表达载体pcDNA4.0中,经酶切鉴定及测序分析、并以脂质体介导转染PC12细胞,了解其在细胞内的表达。结果:酶切鉴定及测序分析,表明重组pcDNA4.0-neuritin表达质粒克隆成功,neuritin基因在PC12细胞中获得表达。结论:以脂质体介导pcDNA4.0-neuritin质粒转染真核细胞,为基因治疗神经系统退行性病变奠定实验基础。

小分子干扰RNA转染效率的初步研究

目的:探讨小分子干扰RNA转染及转染效率的检测方法。方法:化学合成siRNA,转染人脐静脉内皮细胞,通过显微荧光、Western-blot等方法对转染剂的转染效率进行初步的监测和评估。结果:用转染剂siPORTTMNeoFXTM转染FITC标记的阴性对照siRNA和GFP siRNA,具有一定的转染效果,转染效率达35%。结论:检测siRNA转染活性的方法研究,为找到更好的检测方法奠定基础。

经典型Kaposi肉瘤CD164,c-myc的检测

目的探讨差异表达基因在经典型Kaposi肉瘤(KS)中的作用,为揭示KS的发病机制提供新的思路。方法采集经典型KS肿瘤组织、来源于同一患者的正常皮肤组织及血清。运用巢式PCR检测是否感染了人类8型疱疹病毒(HHV-8)。利用抑制性差减杂交(SSH)技术分析KS肿瘤组织差异基因表达谱。结果患者HHV-8检测阳性,在KS肿瘤组织中差异表达的基因28条,包括基因CD164,c-myc。结论基因CD164,c-myc在KS发病机制中可能发挥一定作用,此作用可能与HHV-8病毒感染存在一定的关系。

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。

血红素加氧酶1在新疆卡波氏肉瘤组织中的表达及意义

目的探讨血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和卡波氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma,KS)病因的相关性。方法用Real Time Quantitative PCR(简称RQ-PCR)方法检测7例KS组织中HO-1表达,同时分别以相应瘤旁正常组织和7例正常人正常组织作为对照组。首先抽提7例KS组织、7例瘤旁正常组织和7例正常人正常组织总RNA。以总RNA为模板,逆转录成总cDNA。以总cDNA或目的基因质粒为模板,在Smart Cycler全自动荧光定量PCR分析仪上同时扩增HO-1和GAPDH基因的标准曲线和检测样本中HO-1和GAPDH的表达。结果在KS组织中HO-1表达水平明显高于瘤旁正常组织(t=4.074,P<0.01);也明显高于对照组(t=2.731,P<0.05),并且结果有统计学意义。结论卡波氏肉瘤HO-1表达明显高于瘤旁正常组织和对照组,并且结果有统计学意义,说明HO-1在KS的发病中起到一定作用,具有重要相关性。

实时荧光PCR检测14-3-3β基因在新疆经典型Kaposi肉瘤中的表达

目的应用实时荧光PCR技术,检测14-3-3β基因在新疆Kaposi肉瘤(Kaposi’s sarcoma,KS)中的表达并分析其与KS发生发展的关系。方法2005至2006年收集新疆部分地区的7例经典型KS患者的肿瘤和正常皮肤组织,并经病理活检证实为KS。以SYBRGreenⅠ为荧光指示剂,GAPDH作内参照,建立检测14-3-3βmRNA表达的实时荧光PCR反应体系。分析14-3-3βmRNA的表达与KS发生发展的关系。结果①通过对实验参数的优化,适宜的反应条件为退火温度60℃,循环次数45次;②KS组14-3-3βmRNA的表达明显高于正常对照组(P<0.05)。结论采用SybrGreenⅠ的Smartcycler系统的实时荧光PCR方法检测14-3-3βmRNA快速、简便、稳定性好。14-3-3βmRNA的表达与KS的发生发展有重要关系。

硫氧还蛋白还原酶2基因抗砷作用

目的研究硫氧还蛋白还原酶2(thioredoxin reductase,TrxR2)基因在抗砷细胞(As-ECV304)中的抗砷作用。方法蛋白印迹法(Western Blot)检测As-ECV304和对照组细胞TrxR2蛋白水平,流式细胞仪检测细胞周期分布,化学合成TrxR2基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染As-ECV304细胞,Western Blot验证干扰效率,细胞急性毒性试验检测细胞抗砷性的改变。结果As-ECV304细胞中TrxR2蛋白水平较对照组细胞高,As-ECV304细胞G0/G1期细胞所占比例高于对照细胞。3个siRNA中有一个能特异性抑制TrxR2基因表达,干扰组细胞的生存率低于阴性对照组和未干扰组,3组细胞的半数抑制率IC50分别为9.13,15.88和18.52μmol/L。结论siRNA干扰TrxR2基因表达后能明显降低抗砷细胞的抗砷性,提示该基因在细胞抗砷机制中发挥了重要作用。

用抑制性差减杂交构建As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因文库

目的:构建三氧化二砷(As2O3)诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡相关基因文库。方法:用含4μmol·L-1As2O3和正常培养基培养NB4细胞24h,抽提总RNA,经逆转录酶合成双链cDNA,分别以砷诱导凋亡组和对照组作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(suppress-ion subtractive hybridization,SSH),筛选As2O3诱导的NB4细胞凋亡相关基因,将差异表达基因进行PCR扩增并与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,经蓝白斑筛选获得白色阳性克隆,PCR扩增出未知基因片段。结果:成功构建了分别代表在NB4细胞中表达上调和下调的基因文库。结论:经双向抑制性差减杂交获得了NB4细胞差异表达基因文库,为克隆NB4细胞凋亡相关基因奠定了基础。