单宁酶在黑曲霉中的高效表达及其酶学性质研究

运用基因工程手段,构建高效表达单宁酶的黑曲霉重组菌株,并对重组酶活性及酶学性质进行研究,以期提高单宁酶的表达,更好地实现单宁酶在茶饮料、饲料等行业的重要作用。以内源高表达的glaA基因位点为整合靶位点,集成glaA多拷贝强启动子PglaA6R和信号肽SglaA,构建单宁酶基因AnTan黑曲霉重组表达载体pSZHG6R-AnTan,采用农杆菌介导法转化黑曲霉,获得单宁酶黑曲霉纯合重组菌株A1。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果表明,目的蛋白大小约为76 kDa;以10%糊精为碳源摇瓶发酵至11 d时,酶活最高达到134.36 U·mL^(-1),约为宿主菌株的192倍。酶学性质研究表明,最适温度为50℃,高温时热稳定性较差;最适pH为7.0。K^(+)和Ca^(2+)对重组酶没有影响;Mg^(2+)对重组酶有微弱的促进作用;Zn^(2+)对重组酶有明显的促进作用;Cu^(2+)和Fe^(2+)对重组酶有微弱的抑制作用;Mn^(2+)和EDTA对重组酶有明显的抑制作用。研究结果为进一步优化单宁酶的分泌表达提供了有价值的参考。