人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

目的 利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法 采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED50)为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论 于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。

人乳头瘤病毒及其病毒样颗粒的研究及应用

人乳头瘤病毒（humanpa pillomavirus，HPV）感染是导致尖锐湿疣、宫颈上皮瘤样病变和宫颈癌的主要原因。鉴于HPV的特殊扩增机制，目前尚不能通过体外培养的传统方法来获得病毒用于疫苗研究。HPV的主要衣壳蛋白L1在体外可自行组装成病毒样颗粒（virus-like particle，VLP），形成的VLP在实验动物和人体中均可诱生高滴度的保护性抗体，是理想的预防性疫苗组分。此文就HPV的流行病学、致病机制及其VLP的制备和应用作一综述。

重组人乳头瘤病毒33型L1病毒样颗粒的表达、纯化及免疫原性评价

目的利用毕赤酵母表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)33型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),评价其在小鼠体内的免疫原性。方法构建HPV33 L1表达质粒,电转化毕赤酵母,筛选高表达菌株,15 L发酵罐发酵,离子交换和凝胶体积排阻层析分离纯化HPV33 L1 VLPs,纯化后样品免疫小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠免疫后血清中和抗体滴度。结果质粒HPV33 L1-pPIC3.5K经双酶切及测序鉴定证明构建成功;毕赤酵母表达产物经Western blot分析,可见相对分子质量约56000的目的条带;透射电镜下可见直径约60 nm的病毒样颗粒;纯化后的HPV33 L1 VLPs纯度可达95%以上;0.4和0.04μg HPV33 L1 VLPs免疫后小鼠血清中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为3200和566,差异有统计学意义(P<0.05)。结论利用毕赤酵母成功表达了HPV33 L1 VLPs,并具有良好的免疫原性。

人乳头瘤病毒31型L1病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达及其免疫原性初步评价

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性。方法构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白。将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性。结果经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确。表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合。纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55000,纯度达95%以上。小鼠体内效价ED50值为0.018μg。结论成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性。

人肠道病毒71型病毒样颗粒的制备及免疫原性评价

目的利用巴斯德毕赤酵母制备重组人肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并评价其免疫原性。方法将EV71的P1和3CD基因插入巴斯德毕赤酵母基因组中,构建EV71 VLPs表达质粒,转化巴斯德毕赤酵母KM71感受态细胞,Western blot法筛选高表达克隆,5 L发酵罐发酵,阳离子交换层析和凝胶体积排阻层析纯化EV71 VLPs。用不同剂量(0.05、0.5、5μg)的纯化EV71 VLPs免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清抗体滴度。结果EV71 VLPs表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确。纯化的EV71 VLPs在电镜下可见大小均一、直径约为30 nm的典型VLPs;动态光散射分析显示,EV71 VLPs的流体力学直径为35.82 nm;经0.05、0.5和5μg EV71 VLPs免疫后,小鼠血清ELISA抗体的几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为119、800和3200,差异有统计学意义(P<0.01)。结论EV71 VLPs在巴斯德毕赤酵母中成功表达,且具有良好的免疫原性。

两种重组人乳头瘤病毒52型免疫原性检测方法相关性的比较

目的比较两种重组人乳头瘤状病毒52型(human papilloma viruses type 52,HPV52)免疫原性检测方法的相关性。方法分别采用假病毒体外中和试验(pseudovirus based neutralization assay,PBNA)及酶联免疫吸试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫后小鼠血清中HPV52型中和抗体滴度,比较两种检测方法的相关性。结果重组四价HPV疫苗免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0.765,P<0.01;不同状态HPV52型VLP蛋白颗粒免疫小鼠血清中,HPV52型中和抗体滴度与抗体滴度的Spearman相关系数为0.809,P<0.01。结论采用PBNA法检测的HPV52型中和抗体滴度与ELISA法检测的抗体滴度具有较高的相关性。

重组四价人乳头瘤病毒16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗制剂工艺的优化

目的考察不同制剂工艺流程下制备的重组四价人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗的抗原吸附效果、稳定性及免疫原性,根据实验结果筛选出最合适的制剂配方及工艺。方法通过改变重组四价HPV疫苗的缓冲体系,以及氢氧化铝佐剂的含量、混合工艺、吸附方式与吸附条件,配制不同的实验疫苗,观察其外观,并分别进行蛋白质稳定性、抗原吸附率和小鼠体内半数有效剂量的检测。结果重组四价HPV疫苗原液与450μg/ml氢氧化铝佐剂在pH6.5的组氨酸缓冲体系下混合后的实验疫苗,外观均一性良好,抗原蛋白稳定性最高,熔解温度为87.4℃,小鼠体内免疫原性较好;搅动吸附条件下的4型别HPV抗原吸附率明显高于静止吸附;铝佐剂和抗原蛋白的吸附与混合先后顺序,不同吸附比例、温度和时间对疫苗外观无显著影响,抗原吸附率均大于99.00%。结论确定了重组四价HPV16/18/52/58型病毒样颗粒疫苗合适的制剂工艺条件。