鸡源大肠杆菌CRISPR特征及其与耐药性的关系

【目的】研究鸡源大肠杆菌成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与耐药性的关系,并对CRISPR进行生物信息学分析,为进一步研究CRISPR功能及其对细菌耐药的影响奠定基础。【方法】对从安徽省合肥地区养鸡场分离鉴定的130株鸡源大肠杆菌进行耐药性(16种抗菌药物)和CRISPR检测,分析CRISPR与鸡源大肠杆菌多重耐药的关系。挑选扩增出片段长度不同的12株大肠杆菌,对其CRISPR PCR产物进行测序,通过BLAST进行二级结构预测,用CRISPRTarget等对其重复序列和间隔序列进行生物信息学分析。【结果】130株鸡源大肠杆菌对16种抗菌药物的耐药率为2.3%~97.7%,118株大肠杆菌对3种及3种以上药物耐药;共有39株菌检测到CRISPR,阳性率为30%;CRISPR阳性菌株均为多重耐药菌株,其耐药率(100%)显著高于CRISPR阴性菌株(87%),CRISPR序列差异性与耐药性之间无直接相关性。CRISPR序列同源性较低的12株大肠杆菌均包含2条(11号菌除外)长度为29bp的重复序列,这些序列可分为5类,其RNA二级结构都能形成回文结构,但茎环大小有差异。从这12株大肠杆菌中共发现间隔序列168条,其中77条为新发现序列;同源性比对发现,在112条有比对结果的间隔序列中,72.3%来源于质粒,25.0%来源于噬菌体,2.7%来源于细菌和病毒。【结论】携带CRISPR的鸡源大肠杆菌广泛存在,CRISPR可能与大肠杆菌耐药表型相关,明确了CRISPR的结构特征。

6株鸡柔嫩艾美耳球虫Cytb基因突变及其抗癸氧喹酯药物的差异分析

[目的]研究细胞色素b基因(Cytb)突变与柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)对喹啉类抗球虫药产生抗药性的关系。[方法]收集安徽和县、舒城县、肥东县、庐江县、凤台县和全椒县6个地区的柔嫩艾美耳球虫,经分离、纯化、鉴定和鸡体试验法检测耐药性后,采用PCR法和DNA测序相结合的方法,分析各个地区的野外分离株及敏感株之间Cytb基因的序列突变情况。[结果]获得了1 100 bp的目的片段。测序后发现:与敏感株相比,耐药株中Cytb基因有更多的基因突变,主要表现为T→C、T→A、A→G的突变,其中以T→A的突变最为明显。其中一些碱基的突变引起了氨基酸的改变。[结论]这些碱基的突变有可能是导致柔嫩艾美耳球虫产生对癸氧喹酯抗药性的原因之一。

诱导耐药沙门菌CRISPR检测及cas基因表达分析

[目的]通过对诱导耐药沙门菌成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)比对分析,以及cas(CRISPR associated)mRNA表达水平的变化,探讨CRISPR/Cas与沙门菌耐药性的关系。[方法]对鼠伤寒沙门菌ATCC13311进行耐药诱导分别获得3株体外诱导耐药(环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林)菌和1株体内诱导耐药(环丙沙星)菌,设计引物对CRISPR,进行PCR扩增并检测,应用CRISPR Finder分析CRISPR序列,对5株沙门菌的CRISPR序列进行比对;利用RT-q PCR检测耐药前后沙门菌cas1、cas6、casA mRNA表达水平的变化。[结果]成功扩增出2段CRISPR序列(CRISPR1、CRISPR2),耐药菌碱基的突变均发生在前导区和序列末端;CRISPR1序列的突变发生在前导区的1~4 bp和序列末端的1 136~1 144 bp区域内;CRISPR2序列的突变发生在前导区的1~14 bp和序列末端的780~796 bp区域内;重复间隔序列保守且发现有重复序列的退化现象(degeneration repeats,DRs),同时耐药菌cas1、cas6、casA mRNA的表达水平下降。[结论]提示:沙门菌CRISPR序列突变和cas mRNA表达水平下降与其耐药性有关。

新疆与宁夏部分地区沙门菌的流行特征及耐药性调查

对2020年在宁夏和新疆部分动物养殖场和屠宰场分离的沙门菌(Salmonella)进行了相关抗菌药物的耐药性调查,以了解沙门菌的流行特点以及耐药性情况,一方面为国家动物源细菌耐药网提供数据,另一方面为相关养殖场临床抗菌药物的合理使用提供科学依据。首先采用沙门菌选择性培养基进行菌株的分离、纯化及鉴定,采用微量肉汤稀释法检测16种抗菌药物对分离菌株的最小抑菌浓度(MICs),采用玻片凝集法对分离菌株进行血清型鉴定。结果显示:试验共分离到60株沙门菌,其血清型有16种,主要包括鼠伤寒沙门菌(S.Typhimurium)、里森沙门菌(S.Rissen)、汤普森沙门菌(S.Thompson)、肠炎沙门菌(S.Entertidis)、德尔卑沙门菌(S.Derby)、明斯特沙门菌(S.Muenster),检出率分别为26.67%(16株)、15.00%(9株)、11.67%(7株)、10.00%(6株)、8.33%(5株)、6.67%(4株),其他9种血清型的检出率为1%~5%。分离菌株对磺胺异噁唑、四环素和氨苄西林耐药程度较高,耐药率分别达75.00%、70.00%和66.67%;对奥格门丁和恩诺沙星相对较为敏感,耐药率均为1.67%;对其余9种药物的耐药率在13.33%~56.67%范围内,本次未分离到美罗培南和安普霉素耐药菌株。多数菌株表现为多药耐药。研究结果表明宁夏和新疆部分地区动物源性沙门菌对部分抗菌药物的耐药情况较为严重,养殖场应基于药敏结果合理和谨慎使用抗菌药物,并需加强对畜禽生产全链条中细菌耐药性的常规监测。

批准用于奶牛的抗菌药物分析

我国奶牛养殖规模不断扩大,奶业产值比重逐步提高,给奶牛疫病防治带来巨大压力。奶牛乳房炎及细菌性肺炎等呼吸系统疾病和细菌性肠炎等消化系统疾病最为常见,抗菌药物的使用成为主要防治手段。但抗菌药物的不当使用易使细菌产生耐药性,增加临床治疗的成本和难度,危害我国奶牛产业发展。本文对截至2021年7月我国和美国、英国、日本、欧盟批准用于奶牛的抗菌药物产品进行整理、统计与分析,包括抗菌药物的分类、剂型以及适应证等,旨在为我国奶牛用抗菌药物管理、合理用药和新兽药开发提供参考。

鼠伤寒沙门菌ATCC13311诱导耐药株的转录组测序和分析

为研究鼠伤寒沙门菌ATCC13311和其诱导耐药株在转录组水平上的差异,使用环丙沙星为诱导药物,采用梯度浓度诱导法,诱导鼠伤寒沙门菌ATCC13311产生耐药性。构建ATCC13311和其诱导耐药株TW4的转录组测序文库并进行Illumina RNA-seq双向测序及数据分析。诱导获得ATCC13311对环丙沙星MIC值为4mg/L的耐药菌TW4。测序获得了4.46G有效数据,通过de novo拼接,获得了311条unigene,平均长度为15 587bp。拼接所得到的全序列长度为4 847 532bp,经预测4 998条基因中有4 902条得到GO注释。采用COG功能将注释基因划分为25类。初步确定TW4有3 434个基因表达量显著上升,32个基因表达量显著下降,7条代谢途径表达差异显著。利用转录组测序技术对鼠伤寒沙门菌ATCC13311和其诱导耐药株TW4进行研究,揭示了鼠伤寒沙门菌耐药性诱导前后差异表达的基因和显著变化的代谢途径,为深入研究细菌耐药分子机制及与细菌代谢途径之间的联系提供重要依据。

安徽鸡源大肠杆菌整合子-基因盒分布及同源性分析

参照CLSI推荐的微量肉汤稀释法检测了15种抗菌药物对91株鸡源大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）,采用PCR方法检测其整合子-基因盒的分布情况,并用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析大肠杆菌的同源性。结果显示,91株大肠杆菌对15种抗菌药物的耐药率为3.3%-98.9%,且全部为四重耐药以上,多重耐药率为100%。91株大肠杆菌全部携带Ⅰ型整合子,其中70株带有编码耐氨基糖苷类和磺胺类药物的基因盒,分别是dfr A1＋tnp A IS26＋aad A1（45/70）,dfr A12＋aad A2（16/70）和dfr A1＋aad A1（9/70）,未检出Ⅱ型整合子。PFGE分型图谱显示,91株大肠杆菌共产生63个谱型,菌株之间的相似系数为30%-100%,31种谱型的同源性高达90%以上。其中41种带型只包含1株菌,其余22种带型包含菌株数为2-4株。结果表明,安徽合肥地区鸡源大肠杆菌对抗菌药物的耐药性较高,Ⅰ型整合子分布广泛,菌株基因分布呈多态性但同源性较高。