CK8寡糖链结构及翻译水平改变与人肝癌细胞转移相关性研究

糖组学方法筛查人肝癌细胞转移过程中发挥重要作用的核心岩藻糖基化蛋白质分子,解析比较筛出的差异蛋白——细胞角蛋白8(CK8)翻译及糖基化修饰改变与人肝癌细胞转移潜能的关系.应用双向电泳(2-DE)、凝集素亲和印迹、凝集素亲和沉淀联合质谱分析技术,筛查并验证与肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白;应用细胞免疫荧光和蛋白质免疫印迹检测CK8的蛋白质表达情况;应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹,推测其与肝癌转移相关的寡糖链结构改变.研究发现,3种不同转移潜能人肝癌细胞Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的扁豆凝集素(LCA)亲和印迹表达谱中,分子质量55～60ku、等电点4～6区域处有核心岩藻糖基化蛋白呈差异表达,质谱鉴定为CK8.LCA亲和沉淀及蛋白质印迹进一步验证CK8异常核心岩藻糖基化与肝癌转移相关;研究发现,CK8分布于细胞浆内,在MHCC97-L和MHCC97-H细胞中蛋白质表达水平较Hep3B高,在MHCC97-H中与LCA和蓖麻凝集素(RCA-1)的亲和力较Hep3B强.以上结果提示,2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS/MS分析可用于筛查疾病过程相关的异常糖基化蛋白质分子,CK8蛋白水平、核心岩藻糖基化及β-1,4末端半乳糖基化的增加均与肝癌细胞转移潜能相关.

肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白质表达谱的研究

通过比较研究不同转移潜能肝癌细胞系中核心岩藻糖基化蛋白质表达谱的差别,筛查与转移相关的重要糖蛋白.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、双向电泳(2-DE)和凝集素印迹技术联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立3种不同转移潜能人肝癌细胞系Hep3B、MHCC97L和MHCC97H的核心岩藻糖基化蛋白质表达图谱.比较研究发现,不同转移潜能肝癌细胞呈现不同的SDS-PAGE/LCA凝集素印迹图谱,MHCC-97H和MHCC-97L在35～45 ku和45～60 ku间出现了Hep3B未见的条带.在核心岩藻糖基化蛋白质表达图谱中,Hep3B、MHCC97L和MHCC97H分别平均检测到(55±7)个蛋白质点(n=3),(60±6)个蛋白质点(n=3),(61±4)个蛋白质点(n=3);以各自双向电泳图谱为参考胶,Hep3B、MHCC97L和MHCC97H分别与其匹配的平均匹配点数为(25±3)个(n=3),(30±4)个(n=3),(28±3)个(n=3).该图谱中,与Hep3B相比,MHCC97L有13个点未匹配,其中9个点为Hep3B(-)/MHCC97L(+);MHCC97H有9个点未匹配,其中6个点为Hep3B(-)/MHCC97H(+),MALDI-TOF-MS/MS可鉴定出Annexin1、Keratin 8等12种差异蛋白质.这些结果证实了不同转移潜能的肝癌细胞有明显的核心岩藻基化糖蛋白差异性表达.提示肝癌转移可能与这些差异糖蛋白及其核心岩藻糖基化有关.

人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质的鉴定及生物信息学分析

糖蛋白质组学方法鉴定人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质,将有助于发现肝癌、慢性肝病相关异常核心岩藻糖基化蛋白质.应用凝集素亲和层析技术、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱,图谱均点数为(130±3)个,挖取90个蛋白质点进行质谱鉴定,数据库搜索及去冗余后,共鉴定53种蛋白质,主要分布于pI5～9,分子质量为10～100ku区域处.Gene Ontology分类发现它们参与体内代谢等过程,应用NetNGlyc对它们进行糖基化位点预测,并通过蛋白质免疫沉淀联合凝集素亲和印迹对其中的结合珠蛋白前体,α烯醇化酶的核心岩藻糖基化进行了再验证.以上结果提示,凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS/MS分析是一种鉴定某种特定类型糖蛋白的高通量检测方法,所建立的表达谱可用于发现疾病发生、发展中相关的异常核心岩藻糖基化蛋白质.

大黄素对抗顺铂引起的WI-38细胞凋亡

目的 从细胞水平研究大黄素对顺铂引起WI 38细胞凋亡的影响。方法 采用MTT法检测细胞毒性 ,用形态学观察、DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 WI 38细胞经大黄素和顺铂同时处理 2 2h后 ,30mg·L- 1大黄素可明显减轻顺铂引起的细胞毒性 ,其IC50 值由 (16± 3)mg·L- 1增加至 (34± 6 )mg·L- 1;可明显抑制顺铂引起的细胞形态学改变、核异染色质边集和DNA片段化 ,使顺铂 10和 30mg·L- 1导致的细胞凋亡率由 35 .5 6 %和33.99%降至 9.2 1%和 10 .2 5 % ,S期细胞百分数由6 2 .6 6 %和 4 8.4 6 %降至 4 8.6 7%和 36 .18%。结论 大黄素可对抗顺铂所致WI 38细胞凋亡 。

大黄素对顺铂所致人胚肺成纤维细胞毒性的作用

目的 从细胞水平研究大黄素对顺铂引起人胚肺成纤维细胞毒性的效应。方法 采用MTT法检测细胞毒性 ,荧光法检测细胞氧化性损伤。结果 WI 3 8细胞经大黄素和顺铂同时处理 2 2h后 ,大黄素 (3 0mg L)可明显减轻顺铂引起的细胞毒性 ,其IC50 值由 (16± 3 )mg L增加至 (3 4± 6)mg/L ;可使顺铂引起的细胞内氧自由基水平和细胞内脂质过氧化物水平的升高更加明显 ,使顺铂引起的还原性谷胱甘肽含量的下降更加明显。结论 大黄素可对抗顺铂所致WI 3 8细胞毒性 ,但它不能减少顺铂对细胞的氧化性损伤作用 ,大黄素的预防作用与抗氧化机制无关。

糖基转移酶与肝癌发生

细胞癌变过程中总伴有糖链结构的改变,而糖链又是按一定顺序由糖基转移酶合 成。肝癌发生中许多糖基转移酶的表达或活性都发生改变,这种改变又受到多种因素调控。现 综述肝癌发生中糖基转移酶表达及活性的改变及其在肝癌发生、发展中的作用。

双向电泳-质谱技术筛选肝癌血清标记物

采用双向电泳-质谱技术筛选肝癌特异的血清蛋白标记物,以利于肝癌的早期诊断和治疗.肝癌、肝炎和正常三组各20例血清先采用超声、高丰度蛋白去除、脱盐预处理以优化双向电泳,图像分析三组血清图谱寻找差异点,基质辅助激光解吸飞行时间质谱对差异点进行鉴定.结果显示,通过样品预处理,血清上样体积平均增加3～4倍,参考胶点数由218个增至332个,白蛋白和免疫球蛋白明显减弱,水平条带明显减少.图谱比较所得37个差异点,经鉴定为7种蛋白.与正常组比较,转铁蛋白、甲状腺素运载蛋白在肝炎和肝癌组低表达,α-1抗胰蛋白酶、凝聚素、铜蓝蛋白、触珠蛋白在肝炎和肝癌组均高表达.α-1抗胰蛋白酶在肝癌组较肝炎组高表达,而热休克蛋白27只在肝癌组表达.上述结果提示,双向电泳-质谱技术可发现肝癌发生发展过程中血清蛋白表达谱质或量的变化,从而为肝癌的早期诊断及治疗奠定基础.

热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究

利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.

黄曲霉毒素B1与乙肝病毒协同诱发树鼩肝癌形成过程中的差异表达蛋白

目的比较黄曲霉毒素B1(AFB1)与乙肝病毒(HBV)协同诱发树鼩肝细胞癌生长不同阶段的蛋白质表达谱的改变,筛查在AFB1与HBV共同诱发的肝癌发生发展中起重要作用的关键蛋白质分子。方法用双向凝胶电泳(2-DE)及基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱法(MALDI-TOF-MS/MS)对同一动物自身的癌发生前的肝组织(C45w)、癌发生后的肝癌组织(CCa)及未经AFB1处理的对照组动物肝组织(E45w、E105w)进行了相互比较。结果 C45w组、CCa组、E45w、E105w组分别平均检测到(1233±30)个蛋白点(n=3),(1257±35)个蛋白点(n=3),(1249±51)个蛋白点(n=3)和(1208±36)个蛋白点(n=3)。以各组中2-DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶,分别进行两组间的匹配分析(E45wvsC45w、C45wvsCCa、E45wvsE105w),筛选出两组之间差异大于或等于2倍的蛋白点65个。应用质谱鉴定出细胞色素C氧化酶等25种胶内差异蛋白质。结论在AFB1与HBV共同诱发的树鼩肝癌发生发展不同阶段有明显的差异性蛋白表达谱,为进一步对人肝癌蛋白质组的研究提供了线索。

转移潜能不同人肝癌细胞系差异蛋白Annexin1的功能解析

解析比较蛋白质组学筛出的差异蛋白Annexin1的生物学功能,证实其是否在肝癌转移复发中发挥作用.分别以RT-PCR、蛋白质印迹及细胞免疫化学对差异蛋白Annexin1在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达情况进行再验证,然后构建Annexin1反义表达质粒,转染高转移潜能人肝癌细胞系MHCC97H,通过对MHCC97H细胞的运动、侵袭、凋亡、生长周期、MMPs分泌、克隆形成等系列检测,观察目的蛋白表达降低对其生物学行为的影响,特别是转移特性的影响.验证结果均证实Annexin1在有转移潜能人肝癌细胞系MHCC97L、MHCC97H中呈高表达.转染Annexin1反义重组表达质粒后,MHCC97H细胞中Annexin1的表达被成功抑制.依据MHCC97H/pcDNA3.1(+)ASAnnexin1,MHCC97H/pcDNA3.1(+),MHCC97H的检测排序,转染反义重组质粒后的MHCC97H细胞穿过上室底膜的细胞数(运动实验)分别为:11.13±3.31,18.88±2.03,21.86±3.38;穿过人工基底膜细胞数(侵袭实验)分别是:16.43±2.23,16.40±1.57,16.86±1.52;细胞平均集落形成率(克隆形成实验)分别为:(14.33±0.46)%,(19.35±0.49)%,(20.25±0.35)%;MHCC97H细胞凋亡比例(FCM分析)依次为22.2%,6.44%,6.97%;细胞周期各时相的比例依次为:G0-G1期79.5%/76.34%/80.5%,S期13.26%/14.4%/9.69%,G2-M期7.25%/9.26%/9.81%;细胞培养上清MMP9的定量结果依次为:26.37!g/L,28.00"g/L,31.90#g/L;MMP2定量结果依次为29.46$g/L,26.37%g/L,26.53&g/L.明胶酶谱分析细胞培养上清显示,转染Annexin1反义重组表达质粒的MHCC97H细胞分泌的MMP9活性与对照比变化不明显.综合上述结果发现,转染Annexin1反义表达质粒MHCC97H细胞运动能力及集落形成率明显降低,凋亡细胞的比例增加,而侵袭潜能,细胞周期时相,细胞分泌MMP2、MMP9的量均变化不明显.提示,差异蛋白Annexin1可能通过影响细胞凋亡和细胞运动在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.

肝细胞癌的蛋白质组学研究进展

探讨肝癌发生发展和转移复发的分子机制,寻找早期诊断肝癌、预测转移的生物标记和干预治疗的靶点,已成为当今肝癌研究的热点.随着后基因组时代的来临,蛋白质组学为涉及多基因、多蛋白的肝细胞癌研究创造了新的契机.本文就肝细胞癌的蛋白质组学研究进展作简要综述.多基因、多蛋白的肝细胞癌研究创造了新的契机.本文就肝细胞癌的蛋白质组学研究进展作简要综述.

近交系LEWIS→BN大鼠原位肝移植急性排斥模型的建立

目的建立近交系LEWIS→BN大鼠原位肝移植急性排斥模型,分析手术成功率的影响因素及该模型的稳定性,并总结该模型区别于常规使用的SD、Wistar等封闭群大鼠间原位肝移植的特点。方法实验组选择近交系雄性LEWIS及BN大鼠各30只分别作为供、受体,对照组选择雄性BN大鼠各9只作为供、受体。采用Kamada"二袖套"法实施原位肝移植术,不吻合肝动脉;于术后3,5,7,9,11,13,15d处死受体获取肝脏组织,用中性甲醛固定后制作石蜡切片进行HE染色以判定急性排斥的程度。结果原位肝移植术成功率约为74%,导致手术失败的原因依次为:肝上下腔静脉出血,门静脉出血,麻醉意外和其他;LEWIS→BN组出现不同程度的排斥现象,而BN→BN组则无排斥现象。与封闭群大鼠肝移植比较,该模型具有自身特点,即在排斥出现的时间、程度和结果转归上表现并非完全一致,然而所有受体均出现了排斥现象。结论大鼠肝移植是目前研究肝移植理想模型,本研究采用Kamada的"二袖套"法成功建立了大鼠肝移植急性排斥模型。

肝细胞肝癌组织异黏蛋白的表达变化及临床意义

目的:观察异黏蛋白(metadherin,MTDH)在肝细胞肝癌(HCC)组织中的表达变化,并探讨其可能的临床价值。方法:对含323例肝细胞肝癌患者肿瘤及癌旁正常肝脏组织的组织芯片进行免疫组化染色,分析MTDH的表达情况及其与肝癌患者临床特征之间的关系。进一步采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)结合质谱(mass spectrometry)技术寻找异黏蛋白的功能复合体。结果:免疫组化结果显示MTDH在肝癌组织中表达明显高于癌旁正常肝脏组织,在有微血管侵犯、卫星结节、低分化和TNM分期Ⅱ~Ⅲ期的患者中升高尤其明显(P<0.01)。低MTDH表达组患者的1、3、5年生存率和无复发生存时间明显优于高MTDH表达组(P<0.05)。免疫共沉淀技术发现MTDH能与PRMT5形成蛋白复合体。结论:MTDH有助于判断肝癌患者术后预后,可作为潜在的预后指标。

表观遗传异常在肿瘤发生发展中的研究进展

肿瘤的发生、发展与表观遗传异常改变密切相关,其中5-胞嘧啶碱基甲基化(5-m C)和RNA的N6-甲基腺苷(m-6-A)是常见并极其重要的表观改变,具有高度保守性,几乎存在于所有生物体中,参与调控基因组稳定和表达,在分化发育和生殖过程中起有重要作用。研究发现DNA和RNA的高甲基化表观修饰在恶性肿瘤的发生、发展和侵袭转移中起重要作用。但这一过程可被一些去甲基化酶逆转,其中DNA去甲基化酶TET(ten-eleven translocation)酶家族和异柠檬酸脱氢酶(IDH)可催化5-m C成为5-羟甲基胞嘧啶,而RNA去甲基化酶肥胖风险基因和ALKBH5可逆转RNA的m-6-A修饰。本文综述DNA与RNA甲基化的生物学特征和机制及其在肿瘤中功能的研究进展。

RNA干扰技术在蛋白质组学研究中的应用

人类基因组测序的完成宣告人类已经进入后基因组时代,此后的一个重要任务就是从蛋白质水平对基因的功能进行验证,高通量的蛋白质组(proteome)研究方法应运而生,为筛选有价值的生物蛋白标记提供了有效的方法;而RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术近年来亦已成为研究基因表达功能的强有力工具之一,它可在转录水平对蛋白质的表达进行调控,这两种新兴研究技术的已经互相成为重要的补充。本文将在简介蛋白质组技术、RNAi技术后,对RNAi在蛋白质组学研究中的现状简要作一综述。

“双减”政策下乡村义务教育学生家庭反应行为对策的调查分析

学生家庭反应是影响“双减”政策实施的关键因素。基于对四川省3个市5所学校的148位乡村学生家长的调查发现,当前乡村学生家长群体对于“双减”政策的反应多样,学生家庭反应对于学校减负工作的实施、学生的成长和教育公平有着不同程度的影响。为推动“双减”政策在乡村地区有效落实,需要以乡村学校为主导,多路径寻求家校共育,推动“双减”政策落实;优化学校各级管理,提升“双减”实效。

淋巴结转移对肝内胆管细胞癌患者预后的影响及临床相关因素研究

背景与目的:肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)是原发性肝癌中第二常见的病理学类型,起病隐匿,预后不佳。ICC常出现淋巴结转移(lymph node metastasis,LNM)。探讨肝十二指肠LNM与ICC患者临床相关因素及预后的关系。方法:共招募322例ICC患者在复旦大学附属中山医院行根治性肝肿瘤切除术,分析肝十二指肠LNM与临床病理学特征的关系及预后价值。结果:LNM与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)阳性、血清CA19-9>89 U/mL、肿瘤数目、肿瘤直径(>5 cm)、微血管侵犯、TNM分期、中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophil-tolymphocyte ratio,NLR)显著相关。Kaplan-Meier分析显示,无LNM的ICC患者组的1、3和5年总生存率(overall survival,OS)分别为80.8%、53.4%和40.3%,显著高于伴有LNM组(47.4%、20.4%和10.2%,P<0.001)。无LNM的ICC患者组的1、3和5年无瘤生存率(recurrence-free survival,RFS)分别为62.6%、43.4%和36.3%,显著高于伴有LNM组(25.6%、16.6%和12.4%,P<0.001)。进一步研究发现,血清CA19-9>89 U/mL(P<0.001)、肿瘤直径>5 cm(P=0.042)、肿瘤数目(P<0.001)、微血管侵犯(P=0.022)、TNM分期(P<0.001)、NLR≥2.49(P=0.016)、淋巴细胞/单核细胞比值(lymphocyte-to-monocyte ratio,LMR)<4.45(P=0.048)及LNM(P<0.001)与ICC患者术后无瘤生存时间(time to recurrence,TTR)显著相关;血清CA19-9>89 U/mL(P<0.001)、肿瘤直径>5 cm(P=0.008)、肿瘤数目(P=0.002)、TNM分期(P<0.001)、NLR≥2.49(P<0.001)、LMR<4.45(P=0.002)及LNM(P<0.001)与ICC患者术后OS显著相关。多因素分析显示,血清CA19-9>89 U/mL、肿瘤数目、LNM是影响ICC患者术后TTR的独立预后因素;血清CA19-9>89 U/mL、肿瘤数目、LMR<4.45、LNM是影响ICC患者术后OS的独立预后因素。结论:肝十二指肠LNM是ICC患者术后的独立预后因素,准确判断LNM状态具有重要的临床意义。

环状RNA:非编码RNA研究新方向

环状RNA(Circular RNAs,circRNAs)是一类新型的非编码RNA,其首尾通过共价键形成闭合的环,表现出与线性RNA不同的特性。circRNA大量存在于真核细胞转录组中,在物种间具有保守性,表达稳定且具有组织及发展阶段特异性。circRNA不易被核酸外切酶RNase R降解,在体液中较线性RNA更稳定,因而具有作为临床诊断及预后标志物的潜在应用价值。目前的研究发现环状RNA能够发挥miRNA分子海绵作用,调控基因转录过程。CircRNA在心血管系统疾病、神经系统疾病、朊蛋白疾病及癌症等疾病中发挥重要作用,有望成为RNA领域研究新的热点。

大鼠肝移植(LTx)急性排斥反应(AR)血清蛋白质组学分析

目的探究肝移植(liver transplantation,LTx)急性排斥反应(acute rejection,AR)血清蛋白质组学的变化,寻找与排斥反应相关的血清标志物。方法建立Lewis→BN大鼠肝移植模型,以BN→BN大鼠肝移植为对照组,根据肝移植物AR的反应程度进行分组,取各组大鼠血清样本进行二维双向凝胶电泳(two-dimensional difference gel electrophoresis,2D-DIGE)及质谱(mass spectrometry,MS)分析,鉴定表达有差异的蛋白质。结果肝移植模型大鼠分为无排斥、轻度、中度和重度排斥4组,2D-DIGE共发现30个蛋白斑点,用MS分析排除重复蛋白斑点之后鉴定出14个蛋白质,根据功能可分为4类。第1类为与金属离子代谢相关的免疫调节蛋白,包括血红素结合蛋白、触珠蛋白前体、srprb Ba1-667和preproapo A-I;第2类为先天性免疫相关的蛋白成分,包括补体C3、补体C4a、MBP-A、LOC500183蛋白和LOC299458蛋白;第3类为免疫调节多肽,包括T-kininogen 2、α-1巨球蛋白和大鼠α-1巨球蛋白受体结合域A链晶体结构;第4类为未分类蛋白,包括ORF2和rCG36664。结论肝移植AR过程中血清多种蛋白质的含量发生改变,可能为重要的血清标志物。