ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

目的探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体,通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况,酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量;用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞,通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化,分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响;检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1)mRNA的相对表达情况,分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰;在时相上,除琥珀酰修饰外,随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势,其中以6 h乳酰化修饰最多;ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响;经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上,IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6~8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式,改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

白纹伊蚊rAlb-34k2蛋白对C6/36细胞内的DENV2早期抑制作用

目的探讨白纹伊蚊唾液rAlb-34k2蛋白在DENV2感染C6/36细胞中的作用。方法采用RT-qPCR检测不同浓度rAlb-34k2蛋白作用6 h、60 h后C6/36细胞内DENV2 NS1核酸的变化;采用Dot-ELISA检测rAlb-34k2蛋白与DENV2颗粒结合情况;采用ELISA及Western blot分别检测rAlb-34k2蛋白与C6/36细胞膜蛋白结合的差异。结果rAlb-34k2蛋白作用6 h后,C6/36细胞内DENV2 NS1 RNA的相对表达被抑制,其中10、25、100μg/ml浓度组NS1 RNA的相对表达(2^(-ΔΔCT))值分别为(0.6778±0.04827)、(0.5972±0.06369)和(0.4704±0.05297),差异有统计学意义(P<0.05);rAlb-34k2蛋白作用60 h后,各蛋白组间差异无统计学意义。Dot-ELISA检测rAlb-34k2蛋白(71、118.3、177.5μg/ml)可与DENV2病毒颗粒结合。间接ELISA检测rAlb-34k2蛋白与C6/36细胞疏水性膜蛋白和亲水性膜蛋白结合的A值分别为(1.1±0.26)和(3.1±0.047),差异有统计学意义(P=0.0016),Western blot检测亲水性膜蛋白的阳性结合条带数显著多于疏水性膜蛋白。结论白纹伊蚊雌蚊唾液特异性rAlb-34k2蛋白体外能与DENV2病毒颗粒及C6/36细胞膜蛋白结合,并抑制DENV2病毒早期在C6/36细胞中增殖。

白纹伊蚊rAlb-34k2蛋白诱导小鼠皮肤补体固有成分及CRIg的变化

目的探讨白纹伊蚊唾液特异性34k2重组蛋白(rAlb-34k2)刺激(小鼠腹腔巨噬细胞)RAW264.7及C57BL/6小鼠后补体相关成分mRNA的变化。方法分别用不同浓度rAlb-34k2蛋白刺激RAW264.7细胞和C57BL/6小鼠足垫,采集样本,Trizol提取RNA,逆转录为cDNA后经实时荧光定量PCR方法检测刺激后不同时间各组标本中补体C3、C1q、CfB、CRIg的mRNA变化。结果rAlb-34k2诱导CfB、C3、C1q的mRNA表达上调,且皮肤组织上调幅度高于RAW264.7细胞,其中以CfB mRNA的上调幅度及持续更为显著,在诱导24h时各组(5μg、20μg)2-△△CT值分别是23.90±8.38、8.50±1.64(P<0.05);但刺激12-24h时高剂量组与低剂量组比较上调幅度差异无统计学意义(P>0.05)。在RAW264.7细胞,以刺激6h各种补体固有分成CfB、C3、C1q表达上调,但随时间延长均恢复至正常水平,各剂量组间差异不明显。在局部皮肤组织,rAlb-34k2刺激24h后CRIg表达上调,且呈浓度和时间依赖趋势;48h时,各组rAlb-34k2(5μg、20μg)2-△△CT值达到高峰,分别为8.67±2.44和32.98±9.74,有统计学差异(P<0.05)。在Raw264.7细胞,刺激6h时CRIg有上调表达趋势,但随时间延长而下调,各剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论白纹伊蚊唾液rAlb-34k2蛋白参与调控巨噬细胞及皮肤补体重要成分的表达变化,在组织中尤为显著,且显著上调定居组织的巨噬细胞特异性膜受体CRIg。