重组水蛭素抗大鼠冠状动脉血栓形成的作用研究

目的探讨重组水蛭素(rH)对大鼠冠状动脉血栓形成的抑制作用。方法将160只SD大鼠随机分为8组,每组20只,实验组1～4分别静脉注射rH1.000,0.500,0.250,0.125mg·kg1;实验组5静脉注射Refludan,0.500mg·kg1;实验组6静脉注射肝素2000U·kg1;模型组静脉注射等量0.9%氯化钠注射液;对照组不给药。10min后将大鼠麻醉开胸,将吸有50%三氯化铁溶液的滤纸片贴于实验组1～6和模型组大鼠的冠状动脉前降支根部,60min后取下,以制备大鼠冠状动脉血栓模型。对照组大鼠冠状动脉前降支根部敷贴不含三氯化铁溶液的滤纸片。考察各组大鼠心肌缺血面积评分、左心室伊文思蓝含量、心肌超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,并做心肌病理形态学检查。结果实验组1～5大鼠心肌缺血面积评分分别为12,16,24,28,19分,均明显低于模型组(39分)(均P<0.01);实验组1～3和实验组5,6心肌伊文思蓝含量明显低于模型组(均P<0.01);实验组1心肌SOD活力[(54.64±12.05)NU·mg1]明显高于模型组[(30.46±8.73)NU·mg1](P<0.01),实验组2,3,6心肌SOD活力亦高于模型组(均P<0.05);实验组1,2,5心肌MDA含量明显低于模型组(均P<0.01),实验组3,6亦低于模型组。病理学检查可见实验组3,4大鼠冠状动脉有血栓形成,实验组2血栓形成明显减轻。结论受试rH具有明显?

血栓形成动物模型的研究概况

综述近年来较为常用的血栓模型制备方法及各种方法的原理、特点和用途,旨在为抗血栓药理学的研究提供适用的方法学依据。

蛋白多肽类药物的药动学特点及其影响因素

蛋白多肽类药物药动学十分复杂并受多种因素的影响。该类药物有显著的首过效应 ,其消除半衰期短 ,分布容积较小 ,吸收和消除均可能涉及非线性饱和动力学。结合蛋白、动物种属、给药方案、内源性成分及给药系统等均可影响其药动学过程。近年 ,众多的蛋白多肽类药物有待研发 ,其药动学特点和规律亟待阐明。

靶向MR-1基因shRNA表达载体的构建及其对白血病K562细胞增殖的抑制作用

目的构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响。方法以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamHI和HindIII酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体。将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westernblot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析。结果成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误。将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株。细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低。结论利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低。研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平。

shRNA双表达载体pCSH1的构建及抗肿瘤活性研究

目的构建一种可同时表达靶向两种基因shRNA的瞬时表达载体,以提高RNA干扰效率和降低载体的非特异毒性。方法载体采用pUC19的质粒基本序列,RNA聚合酶III识别的H1启动子,并利用同尾酶的特性设计两个多克隆位点,用DNA重组技术构建了载体pCSH1;以pCSH1为基础,构建靶向N-Ras或c-Myc的单干扰载体,以及靶向N-Ras和c-Myc的双干扰载体,并验证其干扰效率;并用克隆形成法验证了载体的抗肿瘤活性;此外还将靶向N-Ras两个shRNA转录单位串联到一个载体中,检测该连接方式的优势。结果成功设计并构建了可同时表达双基因shRNA的瞬时表达载体pCSH1。对该载体的验证结果表明,靶向N-Ras的单干扰shRNA表达载体pCSH1-shNR或靶向c-Myc的单干扰shRNA表达载体pCSH1-shMyc对靶基因mRNA和蛋白具有明显的干扰作用;双干扰载体pCSH1-shNM也能同时抑制N-Ras和c-Myc的mRNA和蛋白表达水平,且对细胞克隆形成的抑制率最高。细胞生长曲线法检测两个N-Ras-shRNA表达单位串联的载体pCSH1-2shNR对细胞生长的抑制作用,结果显示在质粒质量相同条件下,双表达载体pCSH1-2shNR对细胞的生长抑制作用显著强于单N-Ras-shRNA表达载体pCSH1-shNR,而相同质量的对照质粒pCSH1-2shMock、pCSH1-shMock对细胞生长的抑制没有明显差异。结论利用同尾酶原理构建了一个可同时表达双shRNA的瞬时表达载体pCSH1,该载体可实现双基因同时干扰;pCSH1还具有分子量小、shRNA表达单位可以串联和串联后RNA干扰活性增强的优点。该载体通过同时抑制两个靶基因或增加对单个靶基因的shRNA表达单位可以取得更好的抗肿瘤活性。

山麦冬总皂苷对局灶性脑缺血损伤的保护及抗凝血作用研究

目的:研究山麦冬总皂苷(TSL)对大鼠局灶性脑缺血损伤的保护及抗凝血作用。方法:采用三氯化铁局部涂抹损伤血管的方法复制大鼠大脑中动脉血栓模型,观察TSL对大鼠行为障碍、脑梗死范围、相关脑区组织病理变化、神经型一氧化氮合酶(nNOS)阳性细胞表达率等指标的影响;采用毛细管法及断尾法观察TSL对小鼠出、凝血时间的影响。结果:10、40mg.kg-1TSL可显著减少大鼠脑梗死范围,改善行为学障碍,降低nNOS阳性细胞表达率;20、60mg.kg-1TSL可使小鼠凝血时间及出血时间显著延长。结论:TSL对大脑中动脉血栓所致局灶性脑缺血损伤具有保护作用,并具有显著的抗凝血作用。

力达霉素-单抗Fab＇片段不同连接偶联物的抗肿瘤作用比较

研究力达霉素与抗Ⅳ型胶原酶单抗的不同连接键的小型化免疫偶联物的抗肿瘤作用。制备长短链的二硫键以及硫醚键抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)与抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11的Fab'片段连接的免疫偶联物,ELISA法测定偶联物的免疫活性,体外细胞克隆形成测定和体内荷瘤裸小鼠模型观察两种偶联物的抗肿瘤作用。体外研究显示,Fab'-LDM偶联物部分保留了抗Ⅳ型胶原酶单抗3G11对抗原的亲和力,硫醚键偶联物对体外培养的人纤维肉瘤HT-1080细胞的杀伤作用强于LDM和二硫键偶联物。实验结果显示,LDM等剂量条件下硫醚键偶联物Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组的抑瘤率分别为87.7%和78.0%,二硫键偶联物Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为74.8%和72.3%,游离LDM组为70.9%,相比较长连接键的硫醚键偶联物抑瘤作用显著增强。Fab'-SSMPB-LDM和Fab'-SMBS-LDM组动物的平均生存时间延长为165.8%和145.2%,Fab'-SPDP-LDM和Fab'-LCSPDP-LDM组分别为82.2%和107.5%,LDM组为71.9%。与二硫键偶联物组比较,硫醚键偶联物组能显著延长荷瘤鼠的生存期;长硫醚键偶联物抗肿瘤作用和对荷瘤动物生存期延长作用强于短硫醚键偶联物。长链硫醚键偶联物Fab'-SSMPB-LDM肿瘤生长抑制作用提高,荷瘤动物生存期显著延长,有望开发为新的肿瘤治疗药物。

新型化学修饰siRNAs的设计、合成及生物活性研究

以含取代基团的苯酚和氯代环氧丙烷为原料,经多步反应合成了4种含芳香结构的化学修饰单体,针对靶向Mdm2 mRNA序列的siRNA,在其3'末端加入不同化学修饰的单体制备获得9个siRNAs.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法对所合成的siRNAs进行体外抗肿瘤活性、稳定性测试,结果显示化学修饰的siRNA8,siRNA11,siRNA15对人乳腺癌MCF-7细胞的活性和核酸酶稳定性均有显著提高,其中siRNA11体外对RNA水解酶的半衰期提高了10倍.