肝细胞癌中HIF-1α依赖性的ATP2C1过表达指示不良预后

缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)与肝细胞癌的发生发展相关。HIF-1α在包括肝细胞癌在内的多种癌症类型的发生发展中发挥着重要作用,但其在肝细胞癌中的靶基因尚未完全确定。为找到HIF-1α在肝癌中新的致癌靶点,通过整合HIF-1α敲除的RNA-seq数据,HIF-1α的ChIP-Seq数据,HIF-1α在肝癌中的共表达基因,以及肝癌相关的GEO(Gene Expression Omnibus)数据集,寻找HIF-1α的潜在靶基因。通过分析TCGA(The Cancer Genome Atlas)肝癌数据库、GEO和HPA(Human Protein Atlas)数据集,研究HIF-1α与ATP2C1的相关性,ATP2C1在肝癌中的表达及预后。通过建立物理和化学(氯化钴)缺氧模型验证ATP2C1与低氧及HIF-1α的关系。通过GO(Gene Ontology),KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)和GSEA(Gene Set Enrichment Analysis)分析探索ATP2C1的生物学功能。通过设计体外实验证实ATP2C1对HCC的作用。利用STRING和BioGRID两个蛋白互作在线数据库获得ATP2C1的互作蛋白,并研究其在肝癌中的表达及相关性。通过整合及筛选数据,ATP2C1被鉴定为一个HIF-1α的潜在靶基因。ATP2C1与HIF-1α高度相关,在肝细胞癌中高表达,且伴随有不良预后。富集分析与体外实验的结果表明ATP2C1参与调控HCC细胞的增殖迁移。蛋白互作数据表明ATP2C1与TMEM165存在互作关系,生存分析表明TMEM1651高表达的肝癌患者预后较差。相关性分析的结果显示ATP2C1与肝癌中TMEM165和MMP2的表达高度相关,表明ATP2C1可能与TMEM165和MMP2存在互作关系,并参与了肝癌的进展过程。结果表明,ATP2C1是HIF-1α的靶基因和肝细胞癌的生物标志物,其敲低抑制了HCC的增殖和迁移。

MORF4L1蛋白抗体制备及生物信息学分析

[目的]构建MORF4L1原核表达载体和纯化表达产物,制备MORF4L1蛋白抗体并进行生物信息学分析。[方法]利用PCR将MORF4L1基因片段酶切、克隆、转化至大肠杆菌Bl21(DE3),经IPTG诱导表达蛋白。利用His-Tag技术纯化重组蛋白,用重组蛋白免疫新西兰白兔,采集抗血清后通过硫酸铵沉淀法将多克隆抗体从抗血清中纯化,应用Western Blotting验证多克隆抗体与内外源性MORF4L1蛋白的结合特异性。利用在线软件(GEPIA、UALCAN)进行生物信息学分析。[结果]成功构建了重组蛋白,蛋白纯化后在相对分子质量(Mr)43000位置处有单一条带,重组His-MORF4L1蛋白与His抗体发生特异性结合。制备的抗血清与MORF4L1蛋白特异性结合,纯化后仅在相对分子质量(Mr)55000和25000位置处有条带。纯化的多克隆抗体与内外源性MORF4L1蛋白发生特异性反应。MORF4L1的表达与肝癌不良预后相关。[结论]成功构建MORF4L1蛋白及抗体,MORF4L1在肝癌中高表达预后差,对进一步研究MORF4L1蛋白的结构和生物学功能具有重要意义。