海马G蛋白偶联雌激素受体1参与癫痫调控的转录组学研究

目的本研究分别将野生型(WT)、Gper1敲低(Gper1-KD)大鼠海马组织进行转录组测序,探讨G蛋白偶联雌激素受体1(G-protein coupled estrogen receptor 1,GPER1)影响癫痫发病可能的信号通路和分子机制。方法海马组织进行RNA提取和cDNA文库构建,与NCBI数据库大鼠基因组及基因注释比对,通过FPKM值,筛选组别间差异表达基因(DEGs)。将DEGs进行GO富集、KEGG富集分析,构建蛋白互作网络,利用RT-qPCR法对关键DEGs进行验证。结果Gper1-KD组与WT组相比,筛选(Fold change>2且FDR<0.01)后,检测到DEGs 2253个,其中上调基因1380个,下调基因873个;GO结果显示,DEGs主要分布在淋巴细胞趋化性、细胞分泌、巨噬细胞趋化性、中性粒细胞趋化性、血管生成正向调控等生物过程;KEGG结果显示,DEGs相关分子信号通路主要有癌症信号通路、PI3K-Akt通路、癌症蛋白聚糖相关信号通路、细胞黏附相关通路、MAPK信号通路等;RT-qPCR结果表明,Mapk12、Pdpk1、Foxo3、Camk2d、Pik3cg等基因表达水平差异具有显著性。结论MAPK、TNF信号通路在GPER1影响癫痫发生中可能起关键作用,GABA能神经元和Pik3cg在GPER1影响癫痫易感性方面可能发挥重要作用。

Rg1和GR阻断剂对脂多糖诱导的BV2小胶质细胞iNOS及COX2蛋白表达影响

目的探讨人参皂苷Rg1对脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的作用及糖皮质激素受体(GR)阻断剂RU486的阻断效应。方法用LPS诱导BV2小胶质细胞炎症反应;在无或有RU486预处理细胞的情况下,相继用Rg1和LPS作用细胞。采用免疫印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及环氧化酶2(COX2)水平的变化。结果 LPS可显著上调iNOS和COX2蛋白表达(F=13.42、29.74,q=7.571、15.320,P<0.01),Rg1预保护可明显降低由LPS诱导的iNOS和COX2蛋白表达上调(q=4.889、9.622,P<0.01),此作用可以被RU486所阻断(q=5.905、4.793,P<0.05)。结论人参皂苷Rg1能够抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞iNOS和COX2蛋白表达,此作用可以被GR阻断剂RU486所阻断。

Orexin A预处理对过氧化氢损伤PC12细胞的保护作用

目的观察食欲素(Orexin)A预处理对过氧化氢(H2O2)损伤PC12细胞存活率及凋亡的影响。方法将PC12细胞分为对照组、H2O2组和Orexin A+H2O2组,分别通过噻唑蓝(MTT)、倒置显微镜进行形态观察、流式细胞术对细胞存活率、凋亡细胞形态、细胞凋亡率进行分析。结果 Orexin A+H2O2组细胞存活率显著高于H2O2组,细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著低于H2O2组(P<0.05)。结论 Orexin A能提高H2O2细胞存活率、降低细胞凋亡,发挥神经保护作用。

Rg1对胶质细胞iNOS基因表达的抑制作用及RU486对其影响

目的探讨人参皂苷Rg1对脂多糖(LPS)诱导的原代星形胶质细胞及BV2小胶质细胞炎症反应的抑制作用及糖皮质激素受体(GR)阻断剂RU486对其的影响。方法常规培养原代星形胶质细胞及BV2小胶质细胞,随机分为对照组、LPS组、Rg1+LPS组、RU486+Rg1+LPS组。对照组不做任何特殊处理,其余各组在有或无Rg1预处理条件下,首先加入RU486(1μmol/L)作用1h,继以1mg/L的LPS共同作用细胞6h。应用实时反转录聚合酶链式反应检测各组诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达。结果与对照组比较,加入1mg/L的LPS能明显上调星形胶质细胞和BV2小胶质细胞iNOS基因的表达(F=82.69、18.73,q=21.530、8.974,P<0.01)。与LPS组相比较,加入Rg1能明显抑制LPS对星形胶质细胞和BV2小胶质细胞iNOS的诱导作用(q=9.799、6.640,P<0.01);RU486+Rg1+LPS组与Rg1+LPS组iNOS基因表达比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论人参皂苷Rg1能够抑制LPS诱导的原代星形胶质细胞及BV2小胶质细胞iNOS的基因表达,此作用不能被GR特异性阻断剂RU486所阻断。

阿曼托双黄酮抑制脂多糖诱导的小鼠BV-2小胶质细胞炎症反应

目的探讨阿曼托双黄酮(AF)对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞的炎性因子的阻断效应。方法首先通过CCK-8法筛选出对BV-2细胞活性无影响的AF浓度;在此基础上,采用10mol/L AF预处理BV-2小胶质细胞1 h,加入1.0g/mL LPS诱导细胞炎症反应,通过实时荧光定量PCR检测炎性因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及环加氧酶2(COX2)的mRNA水平,Western blot法检测iNOS及COX2的蛋白水平,免疫荧光细胞化学染色法检测COX2、 iNOS的表达和定位。结果 CCK-8法证明10μmol/L AF对BV-2小胶质细胞活性无明显影响。LPS单独处理可增加BV-2小胶质细胞IL-1β、 TNF-α、 COX2、 iNOS的mRNA表达及COX2、 iNOS蛋白表达;与LPS组相比,10μmol/L AF预给药组能够明显降低IL-1β、 TNF-α、 COX2、 iNOS的mRNA水平及COX2和iNOS的蛋白水平,同时AF可明显抑制COX2及iNOS的表达,抑制BV-2小胶质细胞的激活状态。结论 AF对LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎症反应具有保护作用。

枸杞多糖对大鼠海马细胞癫痫模型的保护作用机制

目的:探讨枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)对大鼠海马细胞癫痫模型的保护作用及其对细胞凋亡、炎症因子的影响。方法:利用无Mg2+培养液建立癫痫细胞模型,设正常组、模型组、枸杞多糖高、中、低剂量组(100,50和25 mg·L-1),CCK8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内游离Ca2+;免疫荧光染色检测线粒体膜电位;分光光度法检测培养基中乳酸脱氢酶含量;RT-PCR检测白细胞介素-1、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、环氧化酶-2基因转录活性。结果:与模型组比较,枸杞多糖给药组细胞存活率增加(P<0.05);凋亡率下降(P<0.05);乳酸脱氢酶含量减少(P<0.05);细胞中游离Ca2+降低(P<0.05);白细胞介素-1、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、环氧化酶-2基因转录活性下调(P<0.05)。结论:枸杞多糖可能是通过下调线粒体凋亡途径和炎症因子的表达发挥其抗癫痫发生作用。

食欲素A对阿尔茨海默病细胞模型存活率的影响及作用机制

目的探讨食欲素A对阿尔茨海默病（AD）细胞模型存活率的影响及机制。方法分别以0、10、20、30、40、50μmol／Lβ-淀粉样蛋白25-35（Aβ25-35）处理PCI2细胞24h，筛选合适的Aβ25-35，浓度用于构建AD细胞模型。建模成功后实验分为3部分：（1）分别加入0（对照组）、0．01、0．1、1、2μmol／L食欲素A预处理细胞24h，然后以30μmol／LAβ25-35处理细胞24h，通过四唑盐（MTT）比色法测定细胞存活率，确定食欲素A适宜干预浓度。（2）采用倒置相差显微镜对对照组、30μmol／LAβ25-35，处理组、0．01μmol／L食欲素预处理组细胞形态进行观察。（3）观察细胞加入食欲素A受体抑制剂SB408124预处理2h后细胞存活率的变化。结果（1）30μmol／LAβ25-35为构建AD细胞模型的最适浓度。不同浓度食欲素A预处理AD细胞模型后，各组细胞存活率差异有统计学意义（F=27．120，P=-0．000），0．01μmol／L食欲素A为适宜干预浓度。（2）30μmol／LAβ25-35处理组部分细胞突起断离，胞体受损。0．01μmol／L食欲素A预处理组细胞突起断离，胞体受损较30μmol／LA1325-35处理组程度减轻。（3）设对照组细胞存活率为100％，加入食欲素A受体抑制剂SB408124后，细胞存活率为（109．10±0．36）％，较0．01μmol/L食欲素A处理组细胞存活率（117．24±2．72）％明显降低，差异有统计学意义（m0．05）。结论食欲素A可通过与受体结合提高AD细胞模型的存活率．可能成为AD防治的一个重要靶点。

G蛋白偶联雌激素受体1对颞叶癫痫大鼠发作易感性的影响

目的探讨G蛋白偶联雌激素受体1(GPER1)特异性激动剂G1、拮抗剂G15对癫痫大鼠发作易感性的影响。方法将60只大鼠按随机数字表法分为对照组、G1处理组、G15处理组,每组20只。后2组大鼠分别腹腔注射GPER1特异激动剂G1(10μg)、拮抗剂G15(40μg),连续注射12 d。3组大鼠均制备氯化锂-匹罗卡品癫痫模型。观察大鼠腹腔注射匹罗卡品后1 h内的行为学表现,每隔5分钟采用Racine分级评估癫痫发作严重程度,比较3组大鼠癫痫发作(Racine分级Ⅳ级)的潜伏期和不同时间点癫痫发作级别。使用脑电监测系统监测大鼠脑电图,记录匹罗卡品注射前10 min到注射后2 h的脑电数据,采用傅立叶变换(FFT)进行脑电的时频分析。比较3组大鼠脑电能量值的分布和癫痫持续状态20 min内θ、α波能量值的变化。结果(1)与对照组、G1处理组比较,G15处理组大鼠的癫痫发作潜伏期明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.05)。注射匹罗卡品后15 min、20 min,G1处理组大鼠癫痫发作分级较对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05)。注射匹罗卡品后15~35 min,G15处理组大鼠癫痫发作分级较对照组高,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)与对照组比较,G1处理组大鼠癫痫发作时脑电波幅较小,而G15处理组大鼠癫痫发作时间较早,且脑电波幅大、频率高。与对照组比较,G1处理组大鼠的脑电能量值变化不明显,而G15处理组大鼠在2 h内呈现出更高的脑电能量值。与对照组和G1处理组比较,G15处理组大鼠在癫痫持续状态20 min内θ、α波能量值明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论GPER1的活性水平与癫痫发作易感性有关,特异性抑制GPER1活性可增强癫痫易感性,增大癫痫过程中特定频率波段的能量值。

利用CRISPR/Cas9技术构建AEG-1基因敲除U251细胞系并探讨其转移行为的特点

星形胶质细胞上调基因-1（astrocyte elevated gene-1,AEG-1）在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中,通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性;然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率;最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体,所构建的载体与实验设计相一致,通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性;成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,Western blot实验结果表明敲除效率高达98%; Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。