含内参的登革和寨卡病毒三重RT-qPCR检测方法的建立与评估

目的 本研究旨在建立一种登革病毒以及寨卡病毒并含人类基因为内参的三重RT-qPCR检测方法,可以同时检测出内参、登革病毒以及寨卡病毒。方法 针对登革病毒4种血清型的保守区域和寨卡病毒的NS1基因以及人类各个组织中稳定表达的β-actin基因,设计3组特异性引物和探针。构建4种血清型的登革病毒、寨卡病毒以及β-actin标准质粒作为阳性质控品,采用L_(9)(3^(4))正交实验方法确定最佳反应条件,对其特异性、灵敏性及覆盖面进行验证与临床评估,并与检测登革病毒的商品化试剂盒进行了一致性评估。结果 本实验建立的三重RT-qPCR检测方法与12种相近虫媒病毒无非特异性交叉反应;对登革病毒与寨卡病毒的检测灵敏度分别为2.99和2.18 copies/μL组内和组间重复性变异系数均在1.5%以内;与商品化试剂盒相比较,该检测方法对13株登革流行病毒均可获阳性结果;经过Bland-Altman一致性分析,商品化试剂盒和该方法对临床阳性样本检测结果一致性达到92.59%。结论 本研究建立了一种特异性强、灵敏度高的含内参的登革病毒和寨卡病毒三重RT-qPCR检测方法,可作为登革病毒与寨卡病毒感染者的早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于病毒暴发地区的快速筛查。

微孔杂交快速检测主要黄病毒方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒Ⅰ-Ⅳ型、流行性乙型脑炎病毒及黄热病毒检测及分型方法。方法在系统分析上述病毒基因组序列基础上,分别设计针对6种病毒的特异性包被探针,扩增、克隆、测序后包被聚乙烯微孔板。随后设计检测用PCR引物,并于引物5′端标记生物素,对待检样品进行扩增后用检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并对包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间等反应条件进行优化。结果初步建立了微孔杂交快速检测上述病毒的方法,试验结果直观,阳性标本吸光度(A)值在0.5以上,阴性结果A值在0.1以下,S/N值在10.0以上。结论PCR-ELISA方法敏感、特异,为上述病毒的快速诊断提供了新的方法。

微孔杂交检测登革病毒及其分型方法的建立

目的建立特异、敏感、实用的登革病毒检测及分型方法。方法分析登革1￣4型病毒基因组序列,分别设计针对登革病毒1￣4型的特异性包被探针,扩增、克隆测序后包被聚乙烯微孔板。PCR上游引物5'端标记生物素,对待检样品进行扩增后用作检测探针进行微孔杂交(PCR-ELISA)反应,并通过设定不同的包被DNA浓度、包被时间、杂交温度、杂交时间,对PCR-ELISA反应进行优化。结果建立了快速、特异、敏感的登革病毒快速检测及分型方法,试验结果直观,阳性标本吸光度值在0.5以上,阴性结果吸光度值在0.1以下,S/N值在10以上。结论所建立的方法可用作登革病毒感染的早期诊断及分型。

南海市登革病毒流行株结构基因序列测定及结构分析

目的对我国登革2型病毒1998年广东省南海市流行株GD08/98结构蛋白基因进行序列测定及分析,为追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系及研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT—PCR扩增,分别克隆到pMD18—T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果此登革病毒株结构蛋白基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株ThNH81/93、NGC、44、TSV01、04及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为98％、94％、94％、92％、92％、90％。结论GD08/98病毒株的结构基因序列基本类似于已发表的其它登革2型病毒株。GD08/98株与ThNH81/93株同源性最高,推测其可能来源于泰国。

登革2型病毒特异性抗原片段的筛选及验证

目的筛选、鉴定登革2型病毒特异性抗原,为进一步研究其生物学功能奠定基础,并利用纯化抗原建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。方法分别利用DNAStar及ANTHEPROT软件对登革病毒1-4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒M、E蛋白进行分析,分析登革2型病毒型特异性抗原表位,并参考GenBank中的序列信息进行比对,分析其在不同登革2型病毒株中的保守性。然后选择预测得分值较高的表位,利用pET32a原核表达系统进行原核表达,Western blotting验证其免疫学反应特异性,特异性片段经亲和层析纯化后,包被ELISA微孔板,并对ELISA反应条件进行系统优化。结果经系统的生物信息学分析,初步预测获得登革2型病毒特异性抗原表位8个,并对其中得分值较高的6段进行了高效表达,经Western blotting分析,获得登革2型病毒特异性抗原片段1段。经纯化后作为检测用抗原,建立了检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。初步应用表明,所建立方法具备良好的特异性,可检测1～200倍稀释的患者血清,S/N比值均在10以上。结论获得登革2型病毒特异性抗原片段1段,并建立检测登革2型病毒抗体的ELISA方法。

基于ARM的液压装置的嵌入式监控系统

以YCS-DIII电液伺服综合实验台液压装置为监控对象,介绍了一种基于ARM的嵌入式监控系统。系统硬件使用AVR实现对装置传感器模拟信号的采集和对液压阀动作的控制,采用S3C2440芯片作为嵌入式主处理器,与AVR串口通讯实现对监控对象的控制和对监控状态的显示。监控系统软件使用Windows CE嵌入式操作系统,采用LabVIEW的Touch Panel Module模块作为嵌入式图形编程开发语言,通过与AVR交换数据和指令,最终在液晶屏交互界面显示液压装置的压力、位置、运动状态等参数。

稳定表达人SidT2基因细胞系的建立及其dsRNA转运功能的研究

目的:构建稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,探讨SidT2基因过表达与细胞转运双链RNA(dsRNA)能力的关系。方法:根据人SidT2基因序列设计引物,克隆其编码区序列,经双酶切后与pEGFP-N3载体连接,构建其真核表达载体,分别瞬时转染BHK及MDCK细胞,并使用G418筛选稳定表达细胞系;在此基础上,体外转录合成绿色荧光蛋白(GFP)dsRNA,以GFP基因为报告基因,进一步分析过表达人SidT2基因对BHK及MDCK细胞转运dsRNA能力的影响。结果:经基因克隆、酶切、连接后,构建了人SidT2基因真核表达载体pEGFP-SidT2;经瞬时转染及G418筛选,获得稳定过表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,实时荧光定量RT-PCR分析表明,其SidT2基因转录水平分别提高71、64.5倍;稳定表达SidT2基因后,在培养液中添加GFP dsRNA,GFP荧光强度较对照细胞分别降低88.1%、73.7%,表明稳定表达SidT2基因的BHK、MDCK细胞转运dsRNA的能力显著增强。结论:构建了稳定表达人SidT2基因的BHK及MDCK细胞系,SidT2基因过表达可显著提高外源性dsRNA的转运能力。

比例分流阀的仿真分析与实验研究

提出了一种比例分流阀的结构。通过建模仿真和试验测试,研究进口流量和负载压差对比例分流阀的分流误差的影响。仿真结果与试验结果基本吻合,进口流量、负载压差及其正负值对分流误差的大小均有影响。试验还表明:比例分流阀在实际工作过程中,由于内泄漏、稳态液动力等因素的影响,导致试验的分流误差值较仿真的分流误差值大。

致病性嗜水气单胞菌气溶素基因PCR检测方法的建立

根据我国致病性嗜水气单胞菌分离株 AH-78-2气溶素 ( Aer)基因保守区的测序结果 ,设计 2对引物 ,建立了检测嗜水气单胞菌的 PCR方法。通过对 2 0株嗜水气单胞菌、1 2株相关菌株及 1 57份送检病料的检测 ,并与 SPA-Co A检测结果对照表明 ,PCR方法具有较高的敏感性与特异性 ,可检测最低 1 0 0 cfu的细菌。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的新途径 。

旋毛虫新生幼虫期特异性T668全长cDNA的克隆及序列分析

利用旋毛虫新生幼虫期特异性 c DNA片段 T6 6 8- SS2作为核酸探针 ,在新生幼虫 c DNA文库中筛选出 10个阳性克隆。序列测定及分子生物学软件分析表明 ,克隆 G10 - 6的 c DNA片段全长 16 0 0 bp,含 12 90 bp的开放阅读框架 ,编码 1个由 4 30个氨基酸残基组成的多肽 ,其相对分子质量理论推导值为 4 6 84 0 ,等电点 (PI)为 9.6 5。主导氨基酸为Ser(11.39% )和 Thr(10 .93% )。开放阅读框架中具有丝氨酸蛋白酶保守功能区及酶活性位点结构 ,其 N末端的信号肽及 2个糖基化位点表明 ,其为分泌性糖蛋白 ,预示其可能在细胞外起着重要作用。DNA同源性分析表明 ,该 c DNA为一新的 c DNA分子。

嗜水气单胞菌的随机扩增多态DNA分型

用 4 5条随机引物对不同来源的 9株嗜水气单胞菌进行了 DNA指纹分析 ,其中 10条引物呈现良好的多态性和稳定性。建立的随机扩增多态 DNA(RAPD)反应的最佳条件 :模板 DNA 2 0 ng,随机引物 0 .8μm ol/ L ,d NTP 15 0μmol/ L,Mg2 + 3.5 mm ol/ L,Taq酶 2 .0 U;95℃预变性 5 min,94℃变性 6 0 s,36℃退火 70 s,72℃延伸 12 0 s,4 0个循环。初步建立了嗜水气单胞菌的 RAPD指纹图谱 ,分析了 9株嗜水气单胞菌之间的遗传距离。据此将 9株菌归为 3个组 ,为该菌的分型提供了新的方法。

I型登革病毒感染后不同病程病毒核酸及其IgM抗体的变化规律

目的探讨I型登革病毒感染后病毒核酸及其IgM抗体在患者体内的变化规律,为指导临床快速、准确地诊断登革热提供理论支持。方法回顾性分析2014年7-11月收集的I型登革病毒感染者临床资料和血清标本,应用实时荧光定量RT-PCR和ELISA法分别检测病毒核酸和IgM抗体,分析不同病程两者的变化规律。结果共检出222例阳性患者,其中病毒核酸阳性137例,IgM抗体阳性146例,两者同时阳性61例。病程急性期(发病1~5 d)病毒核酸阳性率为75%~100%,IgM抗体阳性率在发病第1~2天较低,但第3~5天快速升高至50%~70%;进入恢复期(发病6~10 d)病毒核酸阳性率即快速降低,8 d后仅20%左右,但IgM抗体阳性率显著升高达95%~100%。急性期和恢复期病毒核酸与IgM抗体检测结果构成比差异有统计学意义(χ~2=63.41,P<0.05)。结论 I型登革病毒感染者急性期病毒核酸阳性率在75%以上。恢复期IgM抗体阳性率在95%以上。根据病程合理选择检测方法,可提高登革热的诊断效率。

甘蔗联合收割机液压系统设计方案模糊综合评价法

提出了五种甘蔗收割机液压系统的设计方案,分析了工作可靠性、节能性、操纵性、集成度、经济性、维护性等诸多模糊因素对系统设计的影响;通过运用模糊综合评价法把定性方式描述的各种因素,转化成为用定量方式来描述,并且借鉴了专家的知识经验,对五种设计方案根据不同阶段分别确定权重,进行评价,最后确定了各个阶段最佳的设计方案。

基于PC和PLC的液压通用监控系统

使用FPX-C40R的计算机链接功能,通过MEWTOCOL-COM通信协议实现PC对PLC的数据寄存器的读写访问,以Labview为平台配套上位机监控系统,提高了整套监控系统的控制运算能力,改善了系统功能拓展能力和实现了人机交互界面的美化。设计的通用监控界面包含了液压系统常用共性监控窗口,能实现对液压系统的逻辑控制和对压力、流量、温度等主要运行参数的监测。由于该系统的开源开放性,因此可以方便地对系统源码加以修改以满足专门的测控界面设计要求。该系统具有成本低、通用性好、易于扩展等特点,适用于低频工作的液压系统的监控。

几种重要虫媒病毒单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备登革病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒、西尼罗病毒和基孔肯雅病毒等几种重要虫媒病毒的单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定,为快速检测方法的建立奠定基础。方法通过动物免疫、细胞融合、克隆和筛选等方法制备几种虫媒病毒的单克隆抗体,应用IFA、ELISA方法进行特异性和亚型等的鉴定。结果分别获得的单克隆抗体是登革病毒18株、乙型脑炎病毒5株、黄热病毒8株、西尼罗病毒5株和基孔肯雅病毒7株,大部分是IgG型;大多数单抗有良好的特异性,乙型脑炎病毒和基孔肯雅病毒的单抗无非特异交叉反应,黄热病毒和西尼罗病毒各有一株单抗与乙型脑炎病毒有交叉反应,登革病毒的单抗则表现出较为广泛的交叉反应。结论主要获得了几种重要虫媒病毒特异性好、高效亲和的单抗,为快速检测方法的建立奠定了基础。

海南岛不明发热病人血虫媒病毒分离鉴定及抗体检测

目的从海南岛不明发热病人血中分离和鉴定虫媒病毒,并在当地人群进行抗体检测,以了解南方地区虫媒病毒的感染情况。方法采用微量法细胞培养对205份发热原因不明患者血标本进行病毒分离,应用生物学性状检测、间接免疫荧光试验(IFA)和血凝抑制试验(HI)等技术对分离病毒进行鉴定。采用IFA检测从当地人群血清中分离出的病毒的抗体水平。结果从发热早期患者血标本中分离出2株病毒,鉴定为甲病毒,命名为HF 7和HC 6。这2株病毒与8种甲病毒免疫腹水中的SIN的免疫腹水呈现最高的血凝抑制滴度(分别为1∶160和1∶320),与SIN免疫腹水的交叉荧光效价最高(分别为1∶320和1∶640),但HF 7和HC 6病毒的免疫腹水与8种甲病毒的血凝抑制试验和交叉免疫荧光试验无反应,表明HF 7和HC 6病毒虽与SIN病毒的免疫腹水血抑效价及荧光效价高,但HF 7和HC 6的免疫腹水与SIN病毒无抑制效价和免疫荧光效价。当地人群对这两株病毒感染的抗体阳性率分别为3.3%(15/451)和8.4%(38/451)。结论HF7和HC6为甲病毒的一个新种。海南岛人群存在甲病毒感染。

广州登革病毒1型NS2a-NS2b基因序列分析

目的对2004年广州军区总医院收治的1例疑似登革病毒感染者进行确诊,通过对病毒的基因序列分析,寻找该例感染病毒的可能来源。方法首先从疑似病人的血清提取血液RNA,用RT-PCR法对比较保守的病毒非结构蛋白NS2a-NS2b上的部分序列进行扩增,并进行基因克隆、测序及同源性分析。结果经RT-PCR和基因测序检测证实为DEN1感染;基因序列分析结果表明,该病毒与我室保存的1995年、1997年、1999年和2003年的DEN1流行株非结构蛋白NS2a-NS2b的部分序列同源性分别为90.8%、97.6%、100%和99.6%。结论该例疑似登革病毒感染患者被确诊为DEN1型病毒感染,与1999年广东省中山市的登革1型病毒流行株在部分非结构蛋白NS2a-NS2b上完全相同,并与1997年广东省潮州市和2003年广州市的流行株为同一基因型。由此初步推断,在我国可能已存在登革1型病毒的疫源地。

广东流行的三株登革1型病毒包膜蛋白基因的序列测定与分析

目的通过对广东省不同地区、不同流行期间分离的三株登革1型病毒(DV1)的结构蛋白E基因进行序列测定及分析,了解各流行株之间的遗传差异,追踪其可能的传染来源.方法应用RT-PCR技术扩增病毒的结构蛋白E基因,克隆到PMD18-T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定,应用计算机软件与国内外参考及流行株进行同源性分析,并绘制基因系统发生树.结果3株DV1病毒E基因序列长度均为1 485bp,编码495个氨基酸,核苷酸序列同源性在91%～98%之间,推测的氨基酸序列同源性在94%～99%之间.GD23/95与A88核苷酸(氨基酸)同源性为95%(98%),与其他株的同源性相对较低,2株属同一基因型;GD14/97和GD05/99与Cambodia共享序列非常接近,3株同属另一基因型.结论广东省1997、1999和1995年流行的登革热可能来自境外不同的疫源地.