His-234是毛白杨对香豆酸:CoA连接酶的重要酶催化活性残基

对香豆酸∶CoA连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)是植物苯丙烷类代谢途径中的一个重要的酶.4CL以肉桂酸衍生物(香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等)、ATP和CoA为底物合成相应的酰基-CoA酯,这些酰基-CoA酯是一系列重要化合物(如木质素)的前体.4CL的酶催化反应分两步进行:第一步以肉桂酸衍生物和Mg2+-ATP为底物合成酰基-AMP,第二步用CoA取代AMP,产生酰基-CoA酯,催化过程中酶的构象产生明显的变化.因为4CL在木质素的合成中所起的作用,这个酶是通过蛋白质工程方法改进林产品质量的重要靶标.我们通过X射线衍射技术,解析了毛白杨对香豆酸∶CoA连接酶1(Pt4CL1)与其中间产物对香豆酰-AMP的复合物晶体结构,与同家族成员结构比对,确定所获得的蛋白质结构为Pt4CL1催化第二步反应,即酰基-CoA酯合成的构象.结构分析表明:His-234残基在Pt4CL1的酶催化机理中起着多重作用,即通过侧链与AMP磷酸基团形成氢键,降低磷酸基团的负电荷,催化CoA的亲核取代反应;侧链可以采取两种不同的构象以调节CoA进入Pt4CL1的催化中心;His-234的侧链还可能夺取CoA巯基的质子,从而增强CoA的亲核反应活性.突变体酶活数据结果也显示His-234对Pt4CL1的活性非常重要,是Pt4CL1催化中心的活性残基.

对香豆酰辅酶A酯生物合成及纯化方法

木质素是绿色植物生长发育所需的重要化合物之一。肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)是在木质素合成过程中,催化苯丙烷类合成途径第1步的关键酶。本文以其底物之一——对香豆酰辅酶A酯为例,以现有的辅酶A酯合成纯化的文献报道为参考,介绍经过整合改进并不断试验而得到的CCR底物的合成与纯化方法。从大肠杆菌中提取出来的重组酶4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)用于合成CCR底物,这比从植物组织中提取更易获得。提纯后的4CL可以在-80℃下保存3、4个月。4CL反应后的产物在2个不同梯度下通过C18反相柱进一步纯化,并用高效液相色谱仪监测。在整个纯化过程中,所有用于装载对香豆酸和对香豆酰辅酶A酯的容器都用锡箔纸完全包裹起来。最后提纯出来的产物用质谱和核磁共振检测。检测的结果表明,提纯出来的辅酶A酯单一性非常好。

高通量结核分枝杆菌蛋白可溶表达筛选平台的构建与应用

目的为了改变结核分枝杆菌蛋白质的结构与功能研究由于受结核分枝杆菌蛋白难以可溶性表达和纯化的影响而进展缓慢的问题。方法将多个能促进可溶性表达的蛋白标签与高通量的Gateway克隆技术相结合，构建结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量的筛选平台。挑选46个不同分子量且已知以包涵体形式表达或者不表达的结核分枝杆菌蛋白的基因，分别克隆到带有N-末端的氮源利用物质A（N utilization substance A，NusA）、小分子泛素样修饰蛋白（small ubiquitin-like modifier-1，SUMO）、麦芽糖结合蛋白（maltose-binding protein，MBP）、硫氧还蛋白（thioredoxin A，TrxA）、酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）五种蛋白标签基因的载体上，进行融合表达，分析比较各标签促进可溶性表达的效果。结果融合NusA标签后，19个蛋白以可溶性形式表达，占总样本的41％（19／46）；同时融合SUMO、MBP、TrxA、ACP标签后，可溶性表达的蛋白也分别达到总样本数的22％（10／46）、26％（12／46）、26％（12／46）、22％（10／46）。结论结核分枝杆菌蛋白可溶性表达快速通量筛选平台的建立，实现了结核分枝杆菌重组蛋白可溶性表达的快速通量筛选，为更进一步研究结核分枝杆菌蛋白、特别是重要药物靶标蛋白的结构与功能创造了条件。