阿尔茨海默病患者Hcy、FOL、Vit B_(12)水平与ApoE基因多态性研究

目的:研究阿尔茨海默病(AD)患者同型半胱氨酸(Hcy)、叶酸(FOL)、维生素B_(12)(Vit B_(12))水平与载脂蛋白E(Apo E)基因多态性。方法:选取2020年1月—2022年10月贵州省第二人民医院收治的368例AD患者作为AD组,选取同期收治的326例其他精神类疾病患者作为对照组。检测两组患者的Apo E基因型及Hcy、FOL、Vit B_(12)水平。比较两组Apo E等位基因、ApoE基因型分布情况、Hcy、FOL、Vit B_(12)水平及ε4基因携带情况。比较两组携带ε4基因与未携带ε4基因患者Hcy、FOL、Vit B_(12)水平。结果:AD组ε4等位基因占比高于对照组,ε3等位基因占比低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。AD组ε2/ε3和ε3/ε3基因型占比显著低于对照组,ε3/ε4和ε4/ε4、ε2/ε4基因型占比显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。AD组Hcy水平高于对照组,Vit B_(12)水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。AD组携带ε4患者Hcy水平高于未携带ε4患者,FOL、Vit B_(12)水平均低于未携带ε4患者,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:携带ε4等位基因与高水平Hcy、低水平FOL和Vit B_(12)可能与AD发生有关,或许可作为AD的辅助诊断指标。

PNU上调大鼠皮质星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集

目的探讨PNU激活星形胶质细胞a7胆碱能受体（a7 nAChRs）上调内源性B-晶状体蛋白（Cryab）并抑制β淀粉样蛋白（Aβ）集聚的现象及其机制。方法分离24h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定；体外制备Aβ1-42寡聚体；将细胞分为对照组、PNU组、PNU＋a7nAChRs阻断剂（MLA）组、Aβ1-42组、PNU＋Aβ1-42组、PBK信号通路阻断剂LY294JD02＋PNu＋ANU-Aβ1-42组。用蛋白印迹法检测细胞内Cryab、P·Akt（set473）、AB寡聚体的表达水平。结果（1）PNU可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白（P〈0．05）；应用MLA阻断a7 nAChRs后，PNu上调内源性Cryab蛋白的作用被显著抑制（P〈0．05）；使用LY294002阻断PBK信号通路后，PNU上调内源性Cryab蛋白的作用被显著抑制（P〈0．01）；（2）PNU能够显著上调磷酸化Akt蛋白水平（P〈0．05）；应用MLA阻断a7nAChRs后，PNU上调磷酸化Akt蛋白的作用被显著抑制（P〈0．01）；使用LY294002阻断PBK信号通路后，PNU上调磷酸化Akt蛋白的作用被显著抑制（P〈0．01）；（3）在细胞裂解液及培养基中，PNU显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用（P〈0．01）；使用LY294002阻断PBK信号通路后，PNU增强星形胶质细胞抑制Aβ聚集的功能显著减弱（P〈0．01）。结论PNU通过激活星形胶质细胞a7nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚；PBK／Akt信号通路可能参与PNU激活星形胶质细胞a7nAChRs上调内源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的过程。

PNU282987通过α7神经型尼古丁受体激活PI3K/Akt/HSF1信号通路上调星形胶质细胞内源性αB-crystallin抑制Aβ聚集的研究

目的β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常聚集,导致细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结的形成,从而引发的细胞毒性诱导神经元凋亡,导致渐进性认知功能障碍的临床表现,是阿尔茨海默病(AD)常见发病机制之一。因此,我们研究PNU282987激活SD新生乳鼠大脑皮质星形胶质细胞α7尼古丁乙酰胆碱能受体(n ACh R)后通过PI3K/Akt/HSF1信号通路介导内源性αB-crystallin(Cryab)对Aβ聚集的影响。方法分离出生24 h内SD乳鼠皮质层的星形胶质细胞进行培养、纯化、并传代,通过细胞免疫荧光的方法对星形胶质细胞进行鉴定;体外制备Aβ1-42寡聚体并进行鉴定;将细胞分为空白对照组、MLA处理组、PNU282987处理组、PNU282987+MLA处理组、LY294002处理组、PNU282987+LY294002处理组、Aβ处理组、PNU282987+Aβ处理组、PNU282987+LY294002+Aβ处理组及HSF1敲低组。收集细胞总蛋白,通过Western蛋白印迹法检测p-Akt,Cryab,HSF1和Aβ的蛋白表达水平。结果细胞免疫荧光鉴定显示培养的原代星形胶质细胞占总细胞98%以上;Western蛋白印迹法对细胞中Cryab,p-Akt,HSF1和Aβ表达水平的结果显示:与空白对照组相比较,PNU282987处理后,Cryab,p-Akt,HSF1蛋白都表现出上升的趋势(P<0.05),而单独MLA组或LY294002组无明显差异;在HSF1敲低组,PNU282987上调Cryab的作用受到明显的抑制;正常对照组未检测到Aβ的表达,与Aβ组相比,PNU282987组的Aβ表达降低(P<0.05);与PNU282987+Aβ组相比,PNU282987+LY294002+Aβ组的Aβ表达升高(P<0.01)。结论在原代星形胶质细胞模型上,PNU282987可通过激活星形胶质细胞的α7 n ACh R介导HSF1上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚,PI3K/Akt信号通路很可能是这个过程中的重要参与因素,为探讨Cryab和HSF1可能是治疗AD的一个潜在靶点提供了一定的基础研究。

激活星形胶质细胞α7胆碱能受体后内源性Cryab蛋白的表达

目的：探讨尼古丁激活SD大鼠星形胶质细胞酊胆碱能受体（胡nAChRs）后内源性B-晶状体蛋白（Cryab）表达。方法：分离24h新生乳鼠大脑皮质，原代培养并鉴定为星形胶质细胞后，将培养第3～4代的星形胶质细胞分为正常对照组、尼古丁处理组和d7nAChRs阻断剂（MLA）联合尼古丁处理组；正常对照组不加尼古丁和MLA，尼古丁处理组以1、5及10txmol／L浓度的尼古丁处理星形胶质细胞6、12、18及24h，MLA联合尼古丁处理组以0．05、0．1、0．15及0．2μmol／L浓度的MLA预先处理星形胶质细胞2h后，再加入尼古丁处理组最佳浓度的尼古丁和最佳培养时间培养细胞；运用蛋白印迹（Westernblotting）方法检测3组星形胶质细胞内源性Cryab蛋白的表达。结果：与正常对照组比较，尼古丁处理组的星形胶质细胞内源性Cryab蛋白上调（P〈0．05）；与尼古丁处理组比较，MLA联合尼古丁处理组的星形胶质细胞内源性Cryab蛋白上调受到明显抑制（P〈0．01）。结论：尼古丁激活星形胶质细胞α7nAChRs可上调内源性Cryab蛋白表达，该表达可被MLA阻断。

凋亡诱导因子在阿尔茨海默病患者大脑中的表达及意义

目的：了解凋亡诱导因子（AIF）在阿尔茨海默病患者（AD）脑组织中的表达及亚细胞分布。方法：7例AD患者（AD组）和7例正常老年人（对照组）大脑组织标本，采用免疫组织化学染色法，记录并比较被检脑组织海马Cal、CA2、CA3、DG、内嗅皮质浅层（EcⅠ～Ⅲ）和深层（EcⅣ～Ⅵ）以及颞叶浅层（TCⅠ～Ⅲ）和深层（TCⅣ～Ⅵ）区AIF蛋白阳性表达细胞数，计算AIF总评分和AIF核转移分比。结果：与对照组比较，AD组AIF蛋白在海马CA1、DG以及EcⅠ-Ⅲ区表达显著升高（P〈0．05），在海马CA2、CA3、EcⅣ-Ⅵ及TCⅣ～Ⅵ区的表达无明显变化（P〉0．05）；AD组AIF细胞核转移分比在海马的Cal、CA2、CA3、DG区，内嗅皮质和颞叶皮质均显著高于对照组（P〈0．05）。结论：AIF的细胞核转移可能是AD患者大脑中发生神经细胞凋亡的重要病理因素之一。

尼古丁上调星形胶质细胞内源性Cryab抑制Aβ聚集的研究

目的研究尼古丁激活星形胶质细胞α7胆碱能受体(α7 nicotinic receptors,7 n AChRs)上调内源性B-晶状体蛋白(αB-crystallin,Cryab)并抑制β淀粉样蛋白(Amyloid,Aβ)集聚的现象及其机制。方法分离24 h内新生乳鼠大脑皮质培养原代星形胶质细胞并鉴定;体外制备Aβ_(1-42)寡聚体;将细胞分为对照组、尼古丁组、α7n AChRs阻断剂(methyllycaconitine,MLA)组、Aβ_(1-42)组、尼古丁+Aβ_(1-42)组、PI3K信号通路阻断剂LY294002+尼古丁+Aβ_(1-42)组。用蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞内Cryab、P-Akt(ser473)、Aβ寡聚体的表达水平。结果尼古丁可以显著上调星形胶质细胞内源性Cryab蛋白(P<0.05);尼古丁能够显著上调磷酸化Akt蛋白水平(P<0.05);在细胞裂解液及培养基中,尼古丁显著增强星形胶质细胞对Aβ聚集的抑制作用(P<0.01)。结论尼古丁通过激活星形胶质细胞α7 nAChRs上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚;PI3K/Akt信号通路可能参与尼古丁激活星形胶质细胞α7 n AChRs上调内源性Cryab蛋白抑制Aβ集聚的过程。为进一步研究尼古丁抑制Aβ集聚的可能机制提供了实验基础。

Aβ_(1-42)寡聚体在非Caspase依赖性细胞凋亡通路中的作用机制

目的:观察Aβ_(1-42)寡聚体对凋亡诱导因子(AIF)在神经细胞线粒体或细胞核中表达的影响。方法:将体外培养原代神经细胞分为对照组和Aβ_(1-42)寡聚体处理组,(分别用0.1、0.2、0.5及1μmol/L的Aβ_(1-42)寡聚体处理24 h),采用MTT法测定神经细胞的相对生存率,Western blotting检测凋亡诱导因子(AIF)在神经细胞的线粒体和细胞核中的表达。结果:MTT结果显示,与对照组比较,Aβ_(1-42)寡聚体处理组的OD值均有不同程度的下降,Aβ_(1-42)寡聚体为0.1、0.2及0.5μmol/L时的细胞相对生存率明显降低(P<0.05),1μmol/L时降低最明显(P<0.01);与对照组比较,Aβ_(1-42)寡聚体处理组神经细胞线粒体中AIF蛋白表达减少(P<0.05或P<0.01),而细胞核中AIF蛋白表达升高(P<0.05或P<0.01)。结论:Aβ_(1-42)寡聚体可能通过AIF介导的非Caspase依赖性细胞凋亡通路导致大鼠神经细胞的凋亡,其机制可能与Aβ_(1-42)寡聚体促进AIF从线粒体向细胞核转移有关。

热休克转录因子1及热休克蛋白70与阿尔茨海默病的关系

阿尔茨海默病(AD)是痴呆中最常见的一种神经退行性疾病,越来越多的证据表明,AD是一种"蛋白质错误折叠障碍性疾病",具有蛋白质错误折叠、易聚集和成熟神经系统中选择性细胞丢失的共同特征。热休克蛋白(HSP)是细胞中一组重要的分子伴侣蛋白,它参与了辅助蛋白质合成、折叠、定位及转运等过程,并且在协助蛋白质水解、预防蛋白质错误折叠和聚集方面具有重要的作用,有研究证实HSP与AD存在密切的联系。HSP70是HSP中最保守、最丰富的一个伴侣蛋白。HSP70不但可抑制β-淀粉样肽(Aβ)相关的毒性作用,也在tau蛋白的聚积或降解中发挥重要作用。这些研究结果提示HSP70有可能成为AD治疗的新靶点,本文对HSP70及其上游调控因子HSF1与AD的关系作一综述。

激活原代星形胶质细胞α7尼古丁胆碱能受体对PI3K/Akt/HSP70信号通路的影响

目的研究尼古丁激活星形胶质细胞α7尼古丁胆碱能受体(nAChR)对热休克蛋白(HSP)70表达的影响,探讨激活α7nAChR对阿尔茨海默病(AD)的神经保护作用及其机制。方法从刚出24 h内的小鼠的大脑皮质中分离出原代星形胶质细胞,培养并进行细胞纯度鉴定。将培养好的星形胶质细胞分为空白对照组、尼古丁组、α7nAChR阻断剂MLA组、MLA+尼古丁组、PI3K/Akt信号通路阻断剂LY294002组和LY294002+尼古丁组。用Western印迹法检测细胞内HSP70及P-Akt蛋白的表达情况。结果与对照组相比,尼古丁组中HSP70的表达水平显著升高(P<0.01);与尼古丁组相比,MLA+尼古丁组中HSP70蛋白表达水平受到明显抑制(P<0.05);LY294002+尼古丁组中HSP70蛋白表达水平明显受到抑制(P<0.05);且尼古丁可以显著上调P-Akt蛋白水平(P<0.05),该上调效应能被MLA或LY294002抑制(P<0.05)。结论尼古丁激活星形胶质细胞α7nAChRs,可通过PI3K/Akt信号通路上调HSP70蛋白表达水平。

尼古丁通过PI3K/AKT信号通路上调星形胶质细胞HSF1的表达

目的:研究尼古丁对星形胶质细胞热休克转录因子1(HSF1)的表达的影响,并探讨其机制。方法:分离新出生24 h内乳鼠大脑皮质,进行原代培养并鉴定为星形胶质细胞,待细胞成熟后分为正常对照组、尼古丁处理组,PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002处理组和尼古丁+LY294002处理组,正常对照组不做任何处理;尼古丁处理组用5μmol/L尼古丁分别处理星形胶质细胞6、12、18、24 h; LY294002处理组只加10μmol/L LY294002处理;尼古丁+LY294002处理组是先加10μmol/L LY294002处理2 h后,再加入5μmol/L尼古丁共同处理18 h,免疫印迹法观察各组HSF1蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,尼古丁处理组星形胶质细胞内HSF 1蛋白的表达上调(P <0. 05);与尼古丁处理组比较,LY294002+尼古丁处理组星形胶质细胞内HSF1表达明显受到抑制(P <0. 05)。结论:尼古丁通过PI3K/AKT信号通路上调星形胶质细胞HSF1蛋白表达。

α7胆碱能受体激动剂PNU刺激SD大鼠星形胶质细胞钙调蛋白的表达

目的:探讨α7胆碱能受体(α7nAChRs)激动剂(PNU)对SD大鼠星形胶质细胞钙调蛋白(CaM)表达水平的影响。方法:将培养第3~4代的星形胶质细胞分为对照组、PNU处理组(PNU组)、α7nAChRs阻断剂(MLA)联合PNU处理组(联合组);对照组不加PNU和MLA处理,PNU组以1、5及10μmol/L的PNU处理星形胶质细胞6、12、18及24 h,联合组以0.05、0.1及0.15μmol/L浓度的MLA预先处理星形胶质细胞2 h后,选择加入上调CaM蛋白表达水平最高的PNU浓度和最佳时间(PNU组筛选后所得)处理细胞;运用蛋白印迹(Western blotting)方法检测3组星形胶质细胞CaM的蛋白表达水平。结果 :与对照组比较,1、5及10μmol/L PNU刺激星形胶质细胞6、12、18及24 h可使CaM蛋白表达水平升高(P<0.05);加入5μmol/L PNU培养12 h后,上调作用最明显;联合组(0.05、0.1及0.15μmol/L的MLA预先处理星形胶质细胞2 h后,再加入PNU 5μmol/L培养12 h)与PNU组比较,星形胶质细胞裂解液中CaM蛋白的表达受到抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PNU激活星形胶质细胞后可提高CaM的蛋白表达水平,MLA可阻断该表达。

缺血再灌注诱导PC12细胞发生细胞损伤的分子研究

目的:应用缺血再灌注高分化大鼠嗜铬神经瘤细胞(PC12)体外细胞模型研究细胞缺血再灌注损伤的分子机制。方法:PC12细胞经氧糖剥夺/复氧(OGD/R)处理体外模拟缺血再灌注,分为为对照组(Control组)、OGD 4 h后分别复氧不同时间(R0、R6、R12、R18和R24 h)作为实验组,观察各组细胞自噬和凋亡水平;以细胞自噬和凋亡水平同时最高作为药物干预的模型组,OGD/R+3-MA组细胞先进行3-甲基腺嘌呤(3-MA,2.5 Mm/L)预处理2 h后再行OGD4/R24处理作为药物干预处理组;流式细胞术检测各组(Control组、OGD4 h后复氧不同时间段组)PC12细胞的凋亡率,DCFH-DA荧光探针法检测各组(Control、OGD4 h后复氧不同时间段组)PC12细胞内活性氧(ROS)表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)分析各组PC12细胞自噬标志分子微管相关蛋白轻链-1A/1B(LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)、泛素结合蛋白(P62)和自噬相关基因BECN1(Beclin-1),以及凋亡分子裂解型胱天蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)的表达变化。结果:与Control组比较,OGD4 h后复氧不同时间(R0、R6、R12、R18和R24 h)诱导了细胞凋亡和ROS水平的升高,凋亡和ROS伴随复氧时间的延长而增加(P<0.05),其中OGD4+R24组凋亡和ROS的升高最明显(P<0.05);与Control组比较,OGD4 h后复氧不同时间段(R0、R6、R12、R18和R24 h)组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率、P62、Beclin-1和C-caspase3的表达均增加(P<0.05),其中OGD4+R24组上述自噬和凋亡相关分子的表达升高最明显(P<0.05);与OGD4+R24组比较,OGD/R+3-MA组细胞可以明显降低OGD/R诱导的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率以及Beclin-1、P62和Cleaved-caspase3的表达(P<0.05)。结论:OGD/R诱导了PC12自噬性死亡,其机制可能是OGD/R导致的ROS生成过量导致自噬功能障碍,最终导致细胞自噬性死亡,加剧缺血再灌注损伤。

miR-214-3p对缺糖缺氧再灌注诱导PC12细胞凋亡的作用及机制

目的探讨miR-214-3 p对缺糖缺氧再灌注诱导PC12细胞凋亡的作用及机制。方法利用数据库TargetScan 7.2预测miR-214-3 p和B淋巴细胞瘤因子2样蛋白2(BCL2L2)之间的结合位点;选取人胚肾293T细胞共转染分为BCL2L2 mRNA 3′UTR野生型荧光素酶报告载体+miR-214-3 p mimic(wt+mimic)组、BCL2L2 mRNA 3′UTR野生型荧光素酶报告载体+mimic negative control(wt+NC)组、BCL2L2 mRNA 3′UTR突变型荧光素酶报告载体+miR-214-3 p mimic(mut+mimic)组及BCL2L2 mRNA 3′UTR突变型荧光素酶报告载体+mimic NC(mut+NC组),检测4组293T细胞荧光素酶的发光活性;肾上腺嗜铬神经细胞瘤12(PC12)细胞转染miR-214-3 p mimic(mimic组)、miR-214-3 p mimic NC(mimic NC组)、miR-214-3 p inhibitor(inhibitor组),miR-214-3 p inhibitor NC(inhibitor NC组),采用蛋白免疫印迹法检测BCL2L2蛋白表达;PC12细胞作为对照(Control组),用缺氧缺糖(OGD/R)处理PC12细胞构建缺血再灌注细胞模型(OGD/R组),用miR-214-3 p mimic转染PC12细胞,然后用OGD/R处理PC12细胞(OGD/R+mimic组),采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测Control组和OGD/R组miR-214-3 p及BCL2L2 mRNA表达,采用蛋白免疫印迹法检测Control组、OGD/R组及OGD/R+mimic组裂解胱天蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)、B淋巴细胞瘤-2相关X(Bax)及B淋巴细胞瘤因子2(Bcl2)的蛋白表达。结果数据库Targetscan 7.2预测结果表明,miR-214-3 p与BCL2L2的3′UTR区之间存在结合位点;荧光素酶报告基因实验结果表明,wt+mimic组荧光素酶活性低于wt+NC组,mut+mimic组和mut+NC中荧光素酶活性无明显差异;mimic NC组BCL2L2的蛋白表达高于mimic组,inhibitor NC组BCL2L2的蛋白表达低于inhibitor组(P<0.05);与Control组比较,OGD/R组PC12细胞中BCL2L2 mRNA和蛋白表达水平降低、miR-214-3 p mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);OGD/R组Cleaved-caspase-3和Bax表达分别高于Control组、低于OGD/R+mimic组,但Bcl2表达分别低于Control组、高于OGD/R+mimic组(P<0.05)。结论过表达miR-214-3 p可靶向结合并下调BCL2L2的表达,从而加速PC12细胞的凋亡。

Seipin敲低对内质网应激通路诱导细胞凋亡的影响

目的:探讨Seipin敲低对肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡的影响及其相关机制,初步探索Seipin敲低在帕金森病(PD)模型中的可能调控机制。方法:对细胞给予不同浓度的6-羟多巴胺(6-OHDA,0、25、50、75、100及125μmol/L)处理,用CCK8法检测细胞活性筛选6-OHDA最佳造模浓度;选取阴性对照细胞和Seipin敲低细胞分别用6-OHDA诱导体外PD模型作为阴性模型组和Seipin模型组,同时设阴性正常组和Seipin正常组;4组细胞培养18 h时,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测内质网应激(ERS)蛋白(GRP78和CHOP)和凋亡相关蛋白Bax水平。结果:CCK8法检测细胞活性,6-OHDA最适作用浓度为75μmol/L;Western blot结果显示,与阴性正常组比较,阴性模型组、Seipin模型组GRP78、CHOP及Bax蛋白水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而与阴性模型组相比,Seipin模型组GRP78、CHOP及Bax蛋白水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:敲低Seipin诱导细胞凋亡可能涉及ERS蛋白的增加,敲低Seipin后导致6-OHDA诱导的细胞凋亡更加严重。

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。方法传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型。实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组。CCK8筛选α-LA的有效作用浓度;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western印迹检测细胞促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、酶切caspase-3、自噬标志分子SQSTM-1/P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及mTOR通路的表达变化。结果缺氧/复氧显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05),Western印迹结果显示Bax、酶切caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平均显著升高(P<0.05),P62和p-mTOR的表达水平降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,给予α-LA和Baf A1均能显著降低缺氧/复氧诱导的凋亡水平(P<0.05)。结论α-LA通过抑制缺氧/复氧诱导的过度自噬进而减少过度自噬诱导的细胞凋亡。

核酸内切酶G在帕金森病大鼠脑组织中的表达及意义

目的:探讨核酸内切酶G(Endo-G)介导的非Caspase依赖性细胞凋亡在帕金森病(PD)发生发展中的作用和分子机制。方法:30只SPF级雄性SD大鼠均分为PD模型组(PD组)和对照组(Ctrl组),PD组大鼠右侧纹状体注射6-羟多巴胺(6-OHDA)诱导建立单侧损毁的PD大鼠模型,Ctrl组大鼠注射生理盐水;采用免疫组化实验观察大鼠黑质内酪氨酸羟化酶(TH)的变化以及核酸内切酶G(Endo-G)在黑质中的分布,计算Endo-G核转移细胞率;采用蛋白印迹实验(Western Bolt)检测Endo-G在黑质线粒体和细胞核中的表达量。结果:Ctrl组TH染色阳性神经元结构完整,PD模型组大鼠损毁侧黑质部位TH染色阳性细胞很难见完整的神经元结构;与Ctrl组比较,PD大鼠模型组损毁侧(右侧)黑质线粒体中Endo-G表达量明显降低(P<0.05),而细胞核中Endo-G表达量明显升高(P<0.05);Ctrl组大鼠Endo-G核转移细胞率低于PD组(P<0.05)。结论:在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中,Endo-G自线粒体转位至细胞核,提示非Caspase依赖性细胞凋亡通路可能介导PD大鼠黑质多巴胺能神经元的变形和丢失。

Seipin敲低大鼠PC12细胞株的构建和对细胞凋亡的影响

目的:构建大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的先天性脂肪代谢障碍2型(BSCL2/Seipin)敲低细胞株,探讨Seipin敲低后对细胞凋亡的影响。方法:将PC12细胞分为空白感染组和助感染组(加助感染试剂Hitans G),采用不同慢病毒感染复数(MOI)感染细胞进行病毒预感染试验筛选助感染试剂和合适的MOI;依据上述感染条件,用阴性对照病毒和Seipin-shRNA目的病毒感染PC12细胞作为阴性对照组和Seipin敲低组,同时设置正常组(正常PC12细胞),采用蛋白质免疫印迹法检测Seipin蛋白的表达;将阴性对照组与Seipin敲低组细胞用脱氧核苷酸末端转移酶介导的d UTP缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡染色法和Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡情况。结果:慢病毒MOI=100时感染效果最强,助感染试剂能增加感染效率;与正常组相比,Seipin敲低组Seipin蛋白表达水平降低(P<0.05);与阴性对照组相比,TUNEL染色结果显示Seipin敲低组发红色荧光的凋亡细胞明显增加,Hoechst染色结果显示Seipin敲低组细胞的细胞核致密浓染或碎块状致密浓染程度明显增多。结论:成功构建大鼠PC12 Seipin敲低细胞,下调Seipin蛋白表达会增加细胞凋亡。

PNU通过PI3K/AKT信号通路上调星形胶质细胞HSP70的表达

目的:研究PNU对星形胶质细胞热休克蛋白70(HSF70)表达的影响,并探讨其机制。方法:分离新出生24 h内乳鼠大脑星形胶质细胞原代培养并鉴定,传1～3代待细胞成熟后分为正常对照组、PNU处理组,PI3K/AKT信号通路阻断剂(LY294002)处理组和PNU+LY294002处理组,正常对照组不做任何处理,PNU处理组用5μmol/L PNU分别处理6、12、18、24 h,LY294002处理组只加10μmol/L LY294002处理,PNU+LY294002处理组是先加10μmol/L LY294002处理2 h后、再加入5μmol/L PNU共同处理18 h,免疫印迹法观察各组星形胶质细胞内HSF70蛋白的表达。结果:与正常对照组相比,PNU处理组星形胶质细胞内HSP70蛋白的表达上调(P <0. 05);与PNU处理组比较,LY294002+PNU处理组星形胶质细胞内HSP70表达明显受到抑制(P <0. 01)。结论:PNU通过PI3K/AKT信号通路调控星形胶质细胞HSP70蛋白表达。

星形胶质细胞α7神经型尼古丁受体激动剂Nicotine和PNU对钙调蛋白水平的影响

目的:探讨星形胶质细胞α7神经型尼古丁受体(α7nAChRs)激动剂Nicotine和PNU对钙调蛋白(CaM)表达水平的影响。方法:第3~4代乳鼠大脑星形胶质细胞分为对照组和实验组,对照组不加α7nAChRs激动剂,实验组分别加入α7nAChRs激动剂Nicotine或PNU处理细胞,Nicotine或PNU的浓度为1、5及10μmol/L,处理时间为6、12、18及24 h;采用蛋白印迹(Western blotting)方法检测Nicotine或PNU不同浓度及不同时间点细胞裂解液中的CaM蛋白水平。结果:5μmol/L Nicotine处理6、12、18及24 h和10μmol/L Nicotine处理12、18及24 h的星形胶质细胞裂解液中的CaM蛋白表达水平高于对照组(P<0.05),其余Nicotine浓度和处理时间点星形胶质细胞裂解液中CaM蛋白表达水平虽略高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05);浓度为1、10μmol/L的PNU处理24 h,CaM蛋白表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),其他浓度及时间点的CaM蛋白表达水平均高于对照组(P<0.05)。结论 :星形胶质细胞α7 nAChRs的激活可以使CaM的蛋白表达水平增加。

过表达Seipin对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡的影响

目的构建Seipin过表达PC12细胞株,探讨Seipin过表达后PC12细胞的凋亡情况。方法将PC12细胞分为正常组(未经任何处理的PC12细胞)、阴性组(不带Seipin过表达基因的慢病毒感染的PC12细胞株)和过表达组(带Seipin过表达基因的慢病毒感染的PC12细胞株);进行相应处理后培养24 h,采用荧光显微镜观察红色荧光基因(慢病毒携带的Seipin基因和空载体都包含了红色荧光基因)在细胞中的表达,采用Real time PCR检测BSCL2 mRNA表达水平,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL2-Associated X蛋白质(Bax)的表达水平;TUNEL染色观察细胞内断裂DNA情况。结果正常组未观察到红色荧光,阴性组和过表达组均出现红色荧光,感染效率>80%,提示成功构建Seipin过表达的PC12细胞株;Real time PCR结果显示,过表达组BSCL2 mRNA水平相较正常组和阴性组升高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,过表达组Seipin蛋白表达水平高于正常组和阴性组、凋亡相关蛋白Bax低于正常组和阴性组,差异有统计学意义(P<0.01),TUNEL染色观察到过表达组细胞核荧光强度弱于正常组和阴性组。结论Seipin可能对PC12细胞有保护作用。