多段截骨矫形髓内固定治疗儿童成骨不全症致下肢畸形

成骨不全症(osteogenesis imperfecta)是一种基因异常而影响结缔组织合成的疾病。其中大多数类型是编码Ⅰ型胶原的基因突变所致,其临床特征包括:骨骼脆性增加、骨质疏松、牙齿发育异常、蓝巩膜、关节松弛和脊柱侧弯。成骨不全症患儿因多次骨折、肢体畸形,严重干扰其负重行走功能,临床矫正畸形时面临骨质疏松、内固定容易松动;接骨板固定后因应力改变致接骨板两端易再骨折等问题。2005年8月至2007年12月,23例成骨不全症儿童(33处肢体)接受多段截骨矫形髓内固定治疗。股骨27处、胫腓骨6处。患儿手术时平均年龄8岁3个月(2岁1个月～15岁7个月)。23例患儿均周期性静脉给予帕米膦酸二钠治疗。随访全部23例病例,平均随访时间2年2个月(1年1个月～3年4个月)。全部患儿的父母对手术结果及畸形矫正满意,生活自理能力、活动范围较术前有明显改善。接受帕米膦酸二钠治疗患儿截骨处未表现延迟愈合。

成骨不全及其分子机制

成骨不全作为罕见性遗传性结缔组织疾病,具有临床异质性与遗传异质性,迄今已经分为15个亚型.有常染色体显性遗传与常染色体隐性遗传两种遗传方式.常染色体显性遗传以Ⅰ型胶原蛋白结构基因COL1A1、COL1A2突变为主.非Ⅰ型胶原蛋白突变的常染色体隐性遗传的成骨不全患者数量少,但致病基因种类多,涉及到胶原合成后异常修饰,胶原蛋白分子伴侣及羧基端前肽剪切酶缺陷、成骨细胞与破骨细胞分化及转录因子异常、钙离子通道与Wnt信号通路分子等诸多方面.致病基因及其机制的研究,对于成骨不全的基因确诊及个体化药物治疗意义重大.

成骨不全环状RNA生物信息学分析

目的对成骨不全血清中差异表达的miR-21、miR-26a、miR-29a、miR-29b、miR-30e、miR-34c、miR-133a、miR-145、miR-210、miR-489与miR-1297等共11种miRNAs进行circRNAs及其靶基因的预测,同时分析其与circRNAs及靶基因间的相互作用。方法采用starbase软件对11种差异性表达miRNAs相关circRNAs进行预测,将得到的miRNA-circRNA进行频数分布分析并通过cytoscape软件进行网络分析寻找核心分子。采用miRWALK软件对11种差异性表达miRNAs相关靶基因进行预测,将得到的miRWALK-靶基因进行频数分布分析并通过cytoscape,DAVID软件进行网络分析寻找核心分子。结果 Starbase软件对11种不同miRNAs所预测的靶circRNAs的总数量为222个,非重叠circRNAs为141个。其中MIB1_hsa_circ_000886,MIB1_hsa_circ_002013,CPNE1_hsa_circ_000657,CYP4F3_hsa_circ_001395,KIAA1586_hsa_circ_001439与其中4种miRNA相互作用。另有14个circRNAs与3种miRNA相互作用。miRWALK软件对11种不同miRNAs所预测的靶基因中CNOT6、ELF2、NAV3等基因在不同数量级数据库中与相应不同种miRNAs作用密切。通过对11种miRNA相应circRNA以及靶基因生物学预测分析得到YES1基因与miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713与LMNB2_hsa_circ_001499之间存在相互作用。PPP2CA与miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之间存在相互作用。NTN4和SRGAP1与miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之间存在相互作用。结论本研究对成骨不全血清中差异表达的11种miRNAs及其相互作用的circRNAs、靶基因与相关信号通路进行了网络分析与预测,为进一步分析之间相互作用奠定了基础。

内质网应激与骨细胞及相关骨病的研究进展

内质网(endoplasmic reticulum,ER)作为细胞内重要的膜性结构,负责分泌蛋白与膜蛋白的折叠加工,脂类的生物合成以及钙平衡的调节。当ER环境发生改变,如缺血、缺氧、突变蛋白的大量堆积时,内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)启动,并引发未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和固醇调节级联反应。在应激状态下,ER对维持细胞内稳态起到至关重要的作用。一方面ERS有助于成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的生长,可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化,并抑制细胞凋亡的发生。另一方面在高强度长时间应激状态下,ERS无法维持细胞稳态,会通过多种信号通路诱导细胞凋亡的发生,加速细胞更新。根据近几年已有报道的文献研究整理,在骨质疏松、成骨不全、氟骨症等相关骨病的研究中,ERS同样发挥着重要的调节作用。特别是在发病早期,ERS通过对多种骨细胞的调节,缓解病情。当病情严重ERS会触发内质网凋亡信号,导致细胞凋亡和生物体的损伤。本文就近年来国内外对ERS与骨细胞及相关骨病的研究进展进行综述。

PCR-HRM分析筛查成骨不全一家系患儿基因突变

目的采用PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)分析筛查成骨不全(OI)一家系患儿(先证者)COL1A1基因突变位点,探讨其基因型与临床表型的联系。方法对先证者进行家族史及临床资料的调查,采集先证者、家属及50名正常对照者血液标本,应用PCR-HRM分析筛查先证者及正常对照者COL1A1基因突变,基因测序确证突变位点。结果先证者COL1A1基因17外显子筛查结果异常,其熔解温度(Tm)值比正常对照者Tm值低约0.4℃。先证者与正常对照者的标准熔解曲线及差异熔解曲线均有明显差异。测序结果为c.1138G>A,突变导致380位氨基酸由甘氨酸(Gly)变成丝氨酸(Ser):p.(Gly 380 Ser),为错义突变。先证者父亲、祖母均具有相同突变位点。先证者母亲及正常对照者基因测序结果无此突变。该突变在中国人群中未见报道。该家系遗传特征为常染色体显性遗传,先证者临床诊断为Ⅳ型OI,临床表型较严重。结论 PCR-HRM分析是有效的OI基因筛查新方法。COL1A1基因c.1138G>A突变在中国人群中为新发现的突变位点。α螺旋结构域Gly被替换可能导致较严重的临床表型。

30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折术后康复护理

成骨不全症（Osteogenesis Imperfecta）是以骨脆弱和骨畸形为临床特征的常染色体显性或隐性遗传缺陷的结缔组织病,由于间充质组织发育不全,胶原形成障碍而造成,其发病率大约是1/25 000到1/10 000[1]。大约50%的成骨不全患者均为Ⅰ型,成骨不全患儿一旦发生下肢骨折,往往会造成下肢严重畸形。目前应用可延长髓内钉髓内固定已被证明是最有效治疗方法,稳固术后康复效果,还需要患儿进行康复锻炼[2]。

布鲁克综合征研究进展

布鲁克综合征(BS)是一种常染色体隐性遗传性疾病,患者一般有先天性大关节挛缩和成骨不全的特征,在婴儿期和幼儿期即开始的骨折,产后身材矮小、四肢畸形、翼状胬肉和脊柱侧弯等。根据致病基因的不同,FKBP10和PLOD2基因突变引起的BS分为Ⅰ型(BSⅠ)和Ⅱ型(BSⅡ)。Pub Med数据库迄今收录的BSⅠ型共23个家系39例患者,BSⅡ型共5个家系6例患者,加上早期被报道但未正确分型的20例患者,截至目前有文献报道的病例数为65例。本文从临床特征与基因突变等方面对BS进行综述。

Ilizarov支架在小儿下肢短缩合并成角畸形矫正中的应用

目的探讨Ilizarov支架矫正儿童下肢成角伴短缩畸形安全性与可行性。方法应用矫形外科原则,对2004年8月～2008年7月收治的8例儿童下肢成角伴短缩畸形病例采用Ilizarov支架一期手术、渐进矫形方法治疗。术前测量患肢短缩和成角畸形的程度并确定成角旋转中心的位置。术中支架铰链安置在成角旋转中心水平。术后7 d开始通过调整支架螺杆,逐步同时矫正成角和短缩畸形。随访观察肢体长度、畸形有无复发、关节活动范围、肌力;X线片观察下肢力线、关节水平线与机械轴线角度以及新生骨塑形情况。结果 8例患儿中6例利用微创截骨部位完成矫形与延长,2例于骨折畸形愈合部位截骨矫形、临近骨段延长。术后平均矫正成角畸形33°,平均延长5.2 cm。所有病例下肢机械力线恢复,相关关节角度恢复至正常范围,双下肢等长。最后随访时X线片显示延长骨痂愈合良好,无再骨折。无神经血管损伤发生。结论 Ilizarov支架矫正儿童下肢成角伴短缩畸形是安全可行的,能精确恢复下肢长度与力线,手术并发症少,矫形效果好,避免了多次手术,不足之处在于支架治疗时间长。

成骨不全病人原代成骨细胞中胶原蛋白提取方法改良

目的：本文对成骨不全患者骨骼中胶原蛋白的提取方法进行探讨，拟建立较为稳定的和可控的提取技术。为该病的治疗寻找新思路。方法：选取成骨不全患者在接受外科矫形手术中废弃的骨骼组织，经原代细胞培养后，采用盐析法配合胃蛋白酶消化提取细胞内和培养液中胶原蛋白。分别选取0．05～0．2mM抗坏血酸、0．1～0．25mMβ-氨基丙腈（BAPN）、0．5-1．5mg／mL胃蛋白酶进行梯度实验，比较胶原蛋白提取效果。抗坏血酸作用时间2到5天，每间隔24小时取样一次。胃蛋白酶作用时间，分别为5小时、10小时和20小时三个时间点进行比对。结果：从细胞中和培养液中提取的胶原蛋白，最适的胃蛋白酶消化时间为5小时，作用浓度1mg／mL。培养液中抗坏血酸浓度在0．1-0．15mM之间，β-氨基丙腈浓度达到0．1mM时，连续培养96h以上胶原蛋白产出量较高。结论：实验初步说明，通过优化后的胶原蛋白提取方法，可有效提取患者原代成骨细胞及细胞培养液中的胶原蛋白，

靶向Wnt1的miRNA与circRNA及其靶基因间相互作用的生物信息学分析

为对靶向Wnt1的7种mi RNAs进行circ RNAs及其靶基因的预测,同时分析其与circ RNAs及靶基因间的相互作用,分别采用Starbase及mi RWALK软件,对文献报道的靶向Wnt1基因的let-7e、mi R-21、mi R-34a、mi R-122、mi R-148a、mi R-148b与mi R-152等7种mi RNAs的circ RNAs和对应的靶基因进行生物信息学预测.利用Cytoscape 3.2.1对这7种mi RNAs和预测所得到的circ RNAs及对应的靶基因进行网络分析.并进一步对预测到的靶基因通过DAVID软件进行通路分析.Starbase软件对这7种不同mi RNAs所预测的靶circ RNAs的数量分别为58、15、41、20、28、28、28个.分别比较mi RWALK中7～9个以上软件共有的mi RNAs及其与靶基因的关系,发现CHD7基因是唯一一个在三种不同预测范围内与mi R-21、mi R-148a、mi R-148b和mi R-152等4种mi RNAs相对应的靶基因.CNOT6、NBEA、ZFYVE26与ZDHHC17是在两种不同预测范围内与至少4个mi RNAs相对应的靶基因.在7种mi RNAs所预测靶基因相关的KEGG信号通路中,7～9个软件以上共有的信号通路为Focal adhesion信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路与TGF-beta信号通路.在MAPK信号通路中DUSP1与MRPS35_hsa_circ_001042均分别是与mi R-21、mi R-148a、mi R-148b及mi R-152等4种mi RNAs相互作用的靶基因与circ RNA.本研究对靶向Wnt1的mi RNAs及其相互作用的circ RNAs、靶基因与信号通路等进行了网络分析与预测,为进一步分析它们之间的相互作用奠定了基础.

CircRNA与骨相关疾病

环状RNA(circRNAs)是20世纪70年代被发现的非编码RNA(Noncoding RNAs),在原生生物,真核生物及一系列动植物中广泛存在。通过内含子环化或外显子剪切后拼接形成。具有稳定性高,发育阶段和组织特异性等特点。CircRNAs具有"miRNA分子海绵"功能,影响基因转录调控与表达。目前发现少数circRNAs通过IRES(Internal ribosome entry site)序列或m6A甲基化启动翻译行使编码蛋白的功能,这颠覆了非编码RNA的传统定义。CircRNAs还参与多种信号通路的调节,与多种癌症,神经退行性疾病,粥样动脉硬化等疾病均有密切联系,具有潜在的分子标记物功能。本文概述了circRNAs的形成方式,特点与功能,并系统介绍综述了近年来circRNAs在骨疾病发生、成骨细胞与破骨细胞以及与其他非编码RNA相互作用的研究进展。

改良8字钢板半骺板暂时性阻滞术治疗佝偻病下肢成角畸形

目的：探讨改良8字钢板半骺板暂时性阻滞术治疗佝偻病下肢畸形方法及疗效。方法：佝偻病儿童19例35处膝关节，成角畸形约7°～30°，均接受改良8字钢板手术治疗。结果：术后平均随访时间18个月（6～30个月），31处股骨和胫骨的成角畸形获得满意矫正，并恢复了正常的下肢机械轴线；2例矫形失败，后期行截骨矫形手术。结论：改良8字钢板手术治疗儿童佝偻病膝内外翻畸形，具有手术切口小，骨组织损伤小，螺钉不易断裂，不破坏引导性生长，安全经济，并发症少等特点。

成骨不全14种长链非编码RNA差异表达分析

目的研究14种长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)在成骨不全骨组织中的表达。方法采用先天性骻关节脱位患者骨组织作为对照,应用RT-q PCR分析成骨不全骨组织中14种lnc RNA(ATB、EBIC、HEIH、h LACR1、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC、LSINCTS、Nbla10727、Nbla12061、PRNCR1与UC.388)的表达,使用REST-2009软件进行数据统计分析。结果与对照组相比,14种lnc RNA中仅PRNCR1表达下调并具有显著性差异;ATB、EBIC、HOTAIR、PVT1、LET、Loc285194、SRHC等7种lnc RNA表达差异均小于2倍,LSINCTS表达下调,HEIH、h LACR1、Nbla10727、Nbla12061与UC.388等5种lnc RNA表达上调,但均无统计学意义。结论 PRNCR1在成骨不全骨组织中低表达,其在成骨不全疾病的功能尚有待于进一步研究。

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果 (1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。

帕米磷酸钠对成骨不全成骨细胞和成纤维细胞增殖分化的研究

目的研究双磷酸盐类药物帕米磷酸钠对成骨不全患者原代成骨细胞和成纤维细胞增殖分化的影响。方法实验组:成骨不全患者成骨细胞及成纤维细胞;对照组:先天性髋脱位成骨细胞及成纤维细胞,两组各取三例样本。不同浓度(10-3M～10-10M)帕米磷酸钠分别作用48h、72h。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对细胞增殖的影响;碱性磷酸酶(ALP)活性测定法(ELISA)检测对成骨不全症成骨、成纤维细胞成骨分化的影响。结果药物作用72h效果较明显,(p<0.01);10-3M,10-4M浓度帕米磷酸钠明显抑制两组细胞增殖(p<0.01);10-5M～10-10M浓度的帕米磷酸钠对两组细胞增殖有促进作用,其中实验组成骨细胞和成纤维细胞最佳增殖浓度分别为10-8M和10-6M(p<0.01),对应增殖率可分别达到43%和39%。对照组成骨细胞和成纤维细胞的最佳增殖浓度分别为10-7M和10-5M(p<0.01),对应增殖率为37%和28%。药物浓度在10-5M～10-9M时都促进细胞ALP表达,且ALP活性变化与细胞增殖相一致。其中实验组成骨细胞和成纤维细胞最高ALP活性分别为102U/L和32U/L。结论帕米磷酸钠促进实验组和对照组成骨细胞及成纤维细胞增殖能力和碱性磷酸酶的表达,但是对于实验组细胞的作用更明显。针对成骨不全病人适当的给药方案有利于患者成骨细胞增殖和分化。

IFITM5在不同癌细胞系中的差异表达

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白5(IFITM5)在人骨肉瘤15种细胞系中的表达。方法应用RT-QPCR和Western blot检测IFITM5在SAOS2、3A0、SKOV3、HEPG2、HEP2、ACCM、HT29、MDA-MB-231、H7402、HELA、HEK-293、HL-60、K562、THP1、RD等癌细胞系中m RNA和蛋白表达差异。结果在H7402、RD、HEP2细胞系中IFITM5 m RNA和蛋白的表达水平最低,其他细胞系次之,在SAOS2和3A0细胞系中两者均呈高表达。结论 IFITM5在癌细胞系中存在并有表达差异,为后续研究IFITM5在肿瘤中的作用奠定基础。

多重引物HRMA对成骨不全患者COL1A1/2基因突变的筛查与分析

目的建立多重引物高分辨熔解曲线分析(high resolution melting analysis,HRMA)方法并运用该方法筛查两例成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)COL1A1/2的突变基因。方法收集两例OI患者临床资料,采集患者及50例正常对照的血液标本。设计COL1A1、COL1A2基因103个外显子所对应的引物,将满足一定条件的两对引物相互配对,与单份样本DNA混合作为扩增体系。运用HRMA筛查产物突变情况,基因测序确定突变位点。结果本研究中共涉及到COL1A1和COL1A2的103个外显子,其中成功配对39对,未配对成功的有3个COL1A1外显子和22个COL1A2外显子,成功率为75.73%。先证者1筛查结果HRMA熔解曲线在COL1A141号外显子上存在异常,测序结果为c.2877delT杂合突变,即cDNA2877位碱基T缺失,编码的缬氨酸变成色氨酸。先证者2筛查结果HRMA熔解曲线在COL1A116号外显子上存在异常,测序结果为c.1028delC杂合突变,即cDNA1028位碱基C缺失,编码的脯氨酸变成亮氨酸。两种突变类型在中国人群中均未见报道,为新发现的两种剪切突变,且与传统HRMA筛查结果一致。结论多重引物HRMA方法在传统HRMA基础上进行了创新,将两对引物与单份样本DNA混合作为扩增体系,HRMA筛查产物突变情况,且与传统HRMA筛查结果一致,具有一定创新性和可行性,为成骨不全患者基因突变及其他遗传病致病基因的筛查提供了新的思路。

McCune-Albright综合征患者3例的致病变异鉴定

目的对3例McCune-Albright综合征(MAS)患者进行候选基因GNAS的变异鉴定,以明确其遗传学病因。方法选取2019年4月于山东省立医院就诊和2020年8月、2021年5月于北京协和医院就诊的共3例患者为研究对象。采用酚-氯仿法提取患者及其家系成员的外周血样基因组DNA,通过全外显子组测序(WES)对候选致病变异进行筛查,通过Sanger测序对候选变异进行家系验证。结果测序显示家系1患者存在GNAS基因第8外显子的c.601C>T(p.Arg201Cys)杂合错义变异;家系2和家系3患者均存在GNAS基因第8外显子的c.602G>A(p.Arg201His)杂合错义变异。两种变异均为已知致病变异,患者均为相应致病变异的嵌合体,但比例有所不同。结论WES是鉴定MAS等体细胞遗传病的有效方法。本研究联合应用WES和Sanger测序鉴定了MAS患者致病变异及其嵌合程度,并证实其与患者的表型无明显相关性,为遗传咨询和产前诊断提供了依据。

多段截骨矫形髓内固定治疗儿童成骨不全症

目的探讨对成骨不全症患儿施行多段截骨矫形髓内固定手术的安全性，评价其治疗效果及并发症。方法2005年8月至2010年8月，共收治123例儿童成骨不全症患儿。共160侧肢体：股骨119侧，胫骨41侧。男85例，女38例。患儿手术时平均年龄为8岁3个月（2岁1个月-15岁7个月）。依据修订的Sillenee分型：Ⅲ型45例，Ⅳ型74例，V型4例。术前根据畸形程度，通过术前X线片确定截骨点，术中均行直视下截骨。选用直径及长度适宜的髓内钉，股骨自大转子，胫骨自足底插入。股骨术后行石膏裤、胫骨术后行长腿石膏托固定；术后6周去石膏，开始在支具保护下逐渐站立及行走。123例患儿均周期性静脉给予帕米膦酸二钠治疗，给药时间距手术至少间隔2个月。结果123例患儿全部获得平均38个月（13-64个月）随访。截骨平均术后8周愈合。患儿父母对手术结果及畸形矫正均满意，患儿生活自理能力、活动范围较术前明显改善。14例患儿因出现Rush钉偏移接受再次手术，25例患儿术后2年因骨骼生长Rush钉相对变短而需要更换内固定。结论多段截骨矫形髓内固定术是治疗成骨不全症的有效手术方法，可以显著矫正畸形、改善活动能力和避免再次骨折；但需要注意髓内钉移位等并发症，对生长期儿童需要定期更换内固定。

可延长髓内钉预防成骨不全症儿童股骨再骨折疗效观察

目的探讨可延长髓内钉预防成骨不全症儿童股骨再骨折的疗效。方法回顾性分析2009年6月至2013年6月治疗的35例成骨不全症儿童股骨畸形患儿，男19例，女16例；年龄3岁6个月至13岁1个月，平均9岁3个月。患儿术前股骨曾多次骨折并致骨干弯曲畸形，畸形成角度数为10。-90。，平均55。；其中单侧股骨手术10例，双侧股骨手术25例。术前股骨骨折均未行手术治疗，骨折频率2-4次／年，平均2．4次／年。依据Sillence分型：Ⅰ型12例，Ⅲ型9例，Ⅳ型14例。35例患儿均对弯曲的股骨行截骨矫形、可延长髓内钉内固定。结果35例患儿均获得随访，随访时间36-72个月，平均62个月。股骨截骨愈合时间为7-12周，平均8．5周。复查X线片示截骨愈合后患儿开始进行功能锻炼，至末次随访时80％患儿恢复站立和行走功能。患儿骨折频率明显降低，由术前股骨骨折频率2-4次／年（2．4±1．3次／年），降低到股骨骨折频率0-1次，年，平均0．3次／年（0．3±0．1次／年）。35例患儿家长均对手术结果及畸形矫正效果表示满意。末次随访时患儿Barthel指数评分由术前平均71．82分（范围，51-92分）提高到术后平均92．32分（范围，82±100分）；WeeFIM评分由术前平均53．32分（范围，42-72分）提高到术后平均78分（范围，70±86分）。术后患儿生活自理能力明显改善。术后35例患儿中，22例再次或多次发生不同程度的股骨术后再骨折，其中7例行股骨骨折切开复位可延长髓内钉治疗，15例因骨折无明显移位或者成角畸形而仅行保守治疗，骨折均获愈合。结论可延长髓内钉可以矫正成骨不全患儿股骨畸形、增强肢体强度、有效预防成骨不全症儿童股骨再骨折。