毕赤酵母表达解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶及其水解制备可控结构壳寡糖

优化并全合成解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)壳聚糖酶编码基因并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现分泌表达,表达产物的蛋白质量浓度达到0.23 mg/mL。壳聚糖水解酶的最适pH值为5.0,最适温度为45℃,比活力达52.2 U/mL。该酶在50℃以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物进行了组成及结构分析。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度3～15、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振鉴定结果显示,壳寡糖组分的还原末端及非还原末端均主要由氨基葡萄糖组成。综上,本研究高效表达了来源于解淀粉芽孢杆菌的壳聚糖酶,并制备了确定末端结构的壳寡糖,为壳寡糖的结构与功能关系研究提供理论支持。

强烈炽热球菌几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成与结构分析

利用全基因合成方法合成了强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)的几丁质酶编码基因并在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现了可溶表达。利用该酶对低脱乙酰度壳聚糖进行水解并对获得的壳寡糖产物进行组成及结构分析。分子排阻高效液相色谱结果显示,水解产物相对分子质量分布范围为1 000~5 000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果显示,酶解产物中包含聚合度2~9、不同脱乙酰度的壳寡糖。核磁共振对酶解产物壳寡糖的结构鉴定结果显示,所有寡糖组分的还原端均主要由两个连续的N-乙酰氨基葡萄糖组成。综上,本研究利用来源于强烈炽热球菌的几丁质酶制备了还原末端结构确定的低脱乙酰度壳寡糖,为复杂结构壳寡糖结构与功能关系研究提供了理论支持。

毕赤酵母表达环状芽胞杆菌壳聚糖酶及其水解产物组成与结构分析

壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性,这些生物活性的发挥与其结构直接相关。为最大程度发挥壳寡糖的生物活性并确定其结构与功能关系,有必要制备不同结构特征的壳寡糖。笔者优化并全基因合成环状芽胞杆菌壳聚糖酶基因,利用毕赤酵母进行分泌表达;用该酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖,使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱对其组分进行分离及鉴定,使用核磁共振确定其末端结构特征。结果表明:所得壳聚糖酶蛋白质量浓度达0. 77 mg/m L,水解产物中包含至少37种不同的壳寡糖组分,这些组分的还原末端主要由氨基葡萄糖组成,非还原末端同时包含氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖。本研究为壳寡糖结构与功能关系的阐释奠定基础。

107份小麦历史品种抗穗发芽基因型的检测

为了在历史小麦品种中鉴定出抗穗发芽的种质材料,利用与小麦抗穗发芽相关的分子标记Vp1A3和Vp1B3对107份我国小麦历史品种的穗发芽抗性进行综合筛选。结果表明,属于抗穗发芽单倍型Vp-1Agm的材料有3份,分别是郑州742、陕农17、内乡5号;属于抗穗发芽单倍型Vp-1Bb的材料有10份,分别是跃进5号、泰山1号、济南12、泾阳60、复壮30、丰抗15、济农2号、北京8号、济南矮6号、京130;属于抗穗发芽单倍型Vp-1Bc的材料有48份。在具有发芽指数的77份材料中,平均发芽指数小于10%的抗穗发芽基因型材料有5份,分别为安选2号、烟农15、郑州683、郑州742、克群。该研究结果为小麦抗穗发芽育种中抗性亲本的选择提供了基因水平的依据,拓宽了小麦抗穗发芽育种亲本的选择范围。

纤维素酶制备低脱乙酰度壳寡糖及其组成分析

使用具有壳聚糖水解活性商品纤维素酶对制备的低脱乙酰度壳聚糖进行水解,进而对产物的组成及结构进行分析。分子排阻高效液相色谱(Size exclusion high performance liquid chromatography,SE-HPLC)结果显示,水解产物主要为相对分子质量1000~5000的低聚合度壳聚糖及壳寡糖。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)可对水解物中小分子组分进行有效分离及鉴定,根据一级质谱信息,推测其中含有N-乙酰氨基葡萄糖及17种不同结构的壳寡糖。使用核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)对其进行分析,结果显示,产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,非还原端基本为氨基葡萄糖。综合上述测定结果,推测纤维素酶中发挥壳聚糖水解作用的主要为几丁质酶。

热紫链霉菌几丁质酶表达及低脱乙酰度壳寡糖制备

壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性.与传统的高脱乙酰度壳寡糖相比,低脱乙酰度壳寡糖可能具有更高生物活性.表达热紫链霉菌几丁质酶基因并使用表达产物水解制备低脱乙酰度壳寡糖;优化并全基因合成热紫链霉菌几丁质酶基因,利用毕赤酵母进行分泌表达,对产物酶的性质进行鉴定;利用表达的几丁质酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖,使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(Ultra-performance liquid chromatography quadrupoletime-of-f lightmassspectrometry,UPLC-QTOFMS)对其组分进行分离及鉴定,使用核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)确定其末端结构特征.结果显示,表达的几丁质酶蛋白浓度为0.20 mg/mL,最适pH为5.6,最适温度为60℃,酶活为0.98 U/mL,该酶在80℃及以下时较稳定,该酶水解制备的低脱乙酰度壳寡糖中包含至少35种聚合度2-17、不同脱乙酰度的壳寡糖组分,这些组分的还原末端主要由N-乙酰氨基葡萄糖组成,非还原末端同时包含氨基葡萄糖及N-乙酰氨基葡萄糖.本研究表明毕赤酵母分泌表达的热紫链霉菌几丁质酶具有较好的热稳定性,具有应用于低脱乙酰度壳寡糖规模制备的潜力.(图4表1参22)

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖及其组分分析

对来源于枯草芽孢杆菌菌株168（Bacillus subtilis 168）的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成,并在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现了分泌表达,表达产物的蛋白质浓度达到0.30mg/ml。表达的壳聚糖酶最适p H为5.6,最适温度为55℃,比酶活达84.54U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS）对产物的组分进行了分离及鉴定。根据一级质谱信息,推测酶解产物中包含至少37种聚合度2-18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分。综上,利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因,利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析,可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考。

里氏木霉几丁质酶表达及其水解产物组成与结构分析

优化并全合成里氏木霉几丁质酶基因,在毕赤酵母中实现分泌表达。产物几丁质酶的蛋白浓度达0. 17mg/ml,最适pH为5. 6,最适温度为65℃,酶活为0. 52U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物的组成及结构进行分析。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS）检测及分析结果显示,酶解产物中包含至少41种聚合度2-18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分;核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）检测及分析结果显示,产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,非还原端则同时含有N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖。相关结果可为壳寡糖的结构与功能关系研究提供参考。