鸭源致病性大肠杆菌O抗原与毒力基因检测及药敏试验

【目的】探究荣昌、大足和隆昌三地鸭大肠杆菌分离株的O抗原、毒力基因及耐药性。【方法】将2014年—2021年鸭病料中分离得到的107株细菌在无菌条件下接种于麦康凯培养基中划线进行培养纯化,通过16S rDNA基因扩增测序和生化试验进行细菌鉴定,采用PCR技术对O抗原和16种毒力基因进行检测,采用Kirby-Bauer纸片扩散法进行药敏试验。【结果】107株分离株鉴定为大肠杆菌;O抗原鉴定试验鉴定出9种O抗原,其中优势抗原为O78(37.00%)、O7(25.00%),O121和O145(均为15.00%),并检测到5株O78+O145和O7+O145融合株;共检测出11种毒力因子,其中强致病性毒力基因有Tsh基因(检出率为25.23%)、fyuA基因(检出率为31.78%)、estB基因(检出率为31.78%)、Vat基因(检出率为2.80%)、iucA基因(检出率为44.56%)。3种毒力基因ompA、yijP和ibeB的携带率最高,分别为100.00%、96.26%和85.98%;药敏试验结果表明分离株对氨基糖苷类药物、米诺环素和多黏菌素最为敏感,对大环内酯类药物和克林霉素耐药,分离株均为多重耐药菌,30.00%的分离株表现为7重耐药。【结论】本研究鉴定到107株鸭源致病性大肠杆菌,其致病性和耐药性较强,毒力基因携带情况和耐药性检测发现大肠杆菌的致病力与其耐药性存在一定关系;O抗原检测发现了5株新型O抗原融合株,优势O抗原不断变化,说明西南地区大肠杆菌遗传结构正发生变化,可能存在新的菌体抗原。本研究结果为中国西南地区鸭大肠杆菌病防控及疫苗制备提供依据。

猪细小病毒6型ORF 2基因的截短表达及多克隆抗体制备

【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF 2基因,并制备PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF 2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白大小约为40 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该蛋白可与PPV6阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性;Western blotting间接与ELISA结果显示,纯化后免疫兔血清与PPV6全病毒蛋白发生特异性反应,抗体效价为1∶25600;IFA鉴定结果表明,PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白兔源多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究成功原核截短表达了PPV6 ORF 2基因并制备了兔抗PPV6 VP1(348 aa-675 aa)蛋白多克隆抗体,为PPV6血清学检测方法的建立和PPV6 VP1蛋白的进一步研究提供了参考。

化脓隐秘杆菌间接免疫荧光方法的建立及应用

通过制备兔抗化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes)高免血清,筛选固定方法、封闭液、洗涤液、抗体稀释度、抗体孵育时间等应用条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌的间接免疫荧光方法。结果表明:用冷丙酮作固定剂,10%山羊血清作封闭液,0.05%Tween–20的0.01 mol/L pH 7.4 PBS(磷酸缓冲盐溶液)作洗涤液,兔抗化脓隐秘杆菌高免血清(一抗)1∶50稀释,37℃作用2 h,羊抗兔FITC(二抗)1∶100稀释,37℃作用2 h,草酸铵结晶紫衬染菌体3 min,对纯培养物化脓隐秘杆菌检测,可见清晰的特异性荧光,能区分溶血隐秘杆菌、伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门氏菌、猪链球菌;在人工感染化脓隐秘杆菌死亡小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及发病山羊临床病料中均能检出化脓隐秘杆菌。

解淀粉芽孢杆菌高产纤维素酶菌株的筛选与鉴定

【目的】筛选高产纤维素酶菌株,为牛粪快速无害化降解提供菌剂。【方法】采用平板稀释法从重庆三峡库区3个牛粪堆肥厂样品分离纯化菌株,利用水解圈法和羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose, CMC)酶糖化力法筛选、测定菌株纤维素酶活性,通过菌株形态特征观察、生理生化及分子生物学方法鉴定菌株,采用分子生物学软件MEGA6.0对菌株16S rRNA基因进行遗传系统发育树构建。【结果】从牛粪堆肥样品中分离得到的57株菌株中筛选出10株有较高纤维素酶活性,其中菌株X10纤维素酶活最高,为31.9 U·mL-1。菌株X10鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其在16S rRNA基因遗传系统发育树中与解淀粉芽孢杆菌位于同一簇。【结论】筛选的菌株X10为高产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌,可用于牛粪无害化降解。

海藻糖比伯斯坦杆菌研究进展

海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)属于巴氏杆菌科比伯斯坦杆菌属,是健康羊上呼吸道(鼻咽)和扁桃体正常菌群的一部分。然而,越来越多研究结果表明,海藻糖比伯斯坦杆菌能够感染反刍动物,引起牛呼吸道疾病(BRD)和羊的肺炎,导致其繁殖性能下降,生长发育不良,甚至死亡。目前,海藻糖比伯斯坦杆菌在中国报道较少,为了更好地预防和控制反刍动物呼吸道疾病的发生,需要对海藻糖比伯斯坦杆菌进行深入研究。本文从病原学、致病机制、致病性、基因组特征、检测方法和治疗措施等方面综述了海藻糖比伯斯坦杆菌的研究进展,并对其研究趋势进行了展望。

1株山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌的分离鉴定及药敏试验

为确定引起山羊肺炎的病原,本研究从病死山羊肺脏中分离纯化获得1株细菌,通过生化试验和分子生物学方法鉴定为海藻糖比伯斯坦杆菌。利用生物信息学软件MEGA6.0对巴氏杆菌科5个属细菌的白细胞毒素基因(lktA)和RNA聚合酶β亚基基因(rpoB)分别构建遗传系统发育树,可知分离株与海藻糖比伯斯坦杆菌(AF314526.2、CP003745.1、CP006955.1等)的lktA基因相似性最高,位于同一簇内;分离株和海藻糖比伯斯坦杆菌(CP006956.1、JACI01000002.1、CP003745.1等)的rpoB基因聚类为一簇,相似性最高;而与和葡萄糖苷曼氏杆菌(KU986490.1)的rpoB基因相似性最低。药敏试验显示,该菌对头孢噻肟、头孢他啶和环丙沙星等抗菌药物最敏感,对多西环素、阿莫西林和林可霉素等耐药。本研究为该菌致病机理的研究与疫苗的研发奠定了基础,也为临床用药提供了参考依据。

山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)转铁结合蛋白B的克隆与功能鉴定

山羊海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)是造成山羊肺炎重要病原菌之一,其转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)结构与功能的研究对于阐明其致病机理有重要作用。本研究在前期分离鉴定菌株基础上,通过生物信息学分析结果显示,海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB包含氨基小叶(N-lobe)和羧基小叶(C-lobe)。分别对该菌TbpB^ 20-581 (In-tact)、N-lobe、C-lobe进行克隆、表达与纯化,对纯化的蛋白与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白进行特异性点阵杂交反应,发现山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB In-tact以及N-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白有特异结合反应,而与猪转铁蛋白、鸡转铁蛋白没有反应,山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB C-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白均无反应。结果表明山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB与山羊转铁蛋白结合发生在N-lobe。