藤茶香树脂醇合成酶基因编码区克隆及表达分析

为研究藤茶(Ampelopsis grossedentata)三萜类化合物的生物合成,采用RT-PCR方法,从藤茶叶片cDNA中扩增得到香树脂醇合成酶(amyrin synthase)基因,命名为AgAS。该基因编码区长2 250bp,编码750个氨基酸,与葡萄的同源蛋白亲缘关系最近。亚细胞定位和Southern blot结果表明,AgAS编码蛋白主要定位于细胞核与细胞膜,在藤茶基因组中存在2个拷贝。实时荧光定量PCR结果显示,AgAS基因在紫芽藤茶的根、茎和叶均有表达,其中叶片中表达最高,茎次之,根中表达量最少,且随着叶片成熟程度的增加,表达量呈先升后降趋势;而在绿芽藤茶中,AgAS基因在叶片中的表达量随着成熟程度的增加呈上升趋势,根与茎中表达量相对较少。

响应面法优化红肉火龙果茎多糖的超声波辅助提取工艺

采用响应面分析法对超声波辅助提取红肉火龙果茎多糖的工艺进行优化。选取液料比、超声功率、浸提时间和浸提温度4个因素进行单因素试验,在此基础上进行四因素三水平的响应面优化试验。结果表明,火龙果茎多糖的最佳提取工艺条件为:液料比16.55∶1,超声功率268 W,浸提时间8 min,浸提温度54℃。在此提取条件下,红肉火龙果茎多糖的提取率达到2.755%。

“1+X”证书制度下的中职化工类专业教学改革探索

2019年,国务院发布《国家职业教育改革实施方案》,此方案的发布与实施意味着职业院校、应用型本科高校启动“学历证书+若干职业技能等级证书”制度试点(即“1+X”证书制度试点)工作,促进职业教育逐步形成政府统筹管理、社会多元办学的格局。“1+X”证书制度的制定与实施为中职院校调整和改革教学工作提供了新的思路与方法。文章拟以中职化工类专业为研究对象,着重探讨“1+X”证书制度下中职化工类专业的教学改革路径,旨在提高教学质量的基础上为国家培养出与社会发展需求相适应的技术技能人才,促进国家化工事业稳步有序地发展。

藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定

【目的】查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶,从藤茶中克隆AgCHS1,分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性,通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定,为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础。【方法】根据藤茶转录组测序结果设计引物,以藤茶叶片c DNA和基因组DNA为模板,PCR扩增得到AgCHS1。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建系统进化树。通过原核表达系统获得AgCHS1的重组蛋白,分析该重组蛋白对底物的催化活性,并通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对酶促反应产物进行鉴定。利用qRT-PCR技术对AgCHS1在藤茶不同器官的表达水平进行分析,并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化。构建植物过量表达载体,通过叶盘法转化烟草,筛选阳性转基因后代,对T2代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测。【结果】AgCHS1的ORF长1182 bp,编码393个氨基酸,基因组序列长1315 bp,含2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明,AgCHS1为稳定的亲水蛋白。通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现,AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基,包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点,与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示,AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高,在老叶中的表达量最低。藤茶不同器官的总黄酮含量与AgCHS1表达水平呈显著正相关。体外酶活性分析显示,重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素,说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性。获得5株烟草转基因阳性株系,其中2株的花瓣颜色明显加深;与对照相比,转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6%和25.3%,OE3的黄酮醇含量没有显著差异,OE4的黄酮醇含量提高39.1%。【结论】AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶,过量表达AgCHS1可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量。

藤茶黄烷酮3-羟化酶基因AgF3H的克隆及表达分析

该研究以藤茶叶片为材料,利用RACE技术克隆得到1个黄烷酮-3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因,命名为AgF3H(登录号为JX087441)。AgF3H基因的cDNA全长为1323 bp,其中开放阅读框长1092 bp,编码363个氨基酸,含有双加氧酶家族的2个特征性结构域和5个保守基序。序列比对与系统进化树分析显示,AgF3H与其他物种F3H的氨基酸序列具有较高的相似性,且与葡萄、山葡萄和圆叶葡萄的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示,AgF3H基因在藤茶不同组织部位都有表达,在芽中的表达量最高,嫩茎中最低,在叶片中的表达量随着成熟度的增加而逐渐降低;不同组织中的AgF3H基因表达量与藤茶类黄酮主要成分二氢杨梅素的含量呈显著正相关。构建AgF3H基因过表达载体并导入烟草中,获得5株转基因植株,其中4株烟草的叶片总黄酮含量比野生型对照有不同程度提高,最高株系提高了26.8%。研究表明,AgF3H基因可能在藤茶类黄酮的生物合成中起重要作用,研究结果为进一步研究藤茶高黄酮含量形成的分子机制奠定了基础。

仿真软件在化工专业课程教学模式中应用的研究

在"1+X"证书制度改革的背景下,化工仿真软件已广泛运用于化工专业实践课程教学中,取得了良好的效果。它不仅提高了化工单元专业知识,而且有效提高了化工专业实践课程的课堂效率。本文通过对仿真软件在化工专业实践课程中的运用进行讨论,分析仿真软件在化工实践教学课程中的优点和局限性,并提出应用策略。

显齿蛇葡萄实时荧光定量PCR内参基因的筛选与验证

目的筛选适用于显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)的内参基因。方法设计简并引物,采用RT-PCR从显齿蛇葡萄中克隆6个候选内参基因片段,包括肌动蛋白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、18 S核糖体rRNA基因(18 S-rRNA)、α-微管蛋白基因(α-Tubulin)、β-微管蛋白基因(β-Tubulin)和多聚泛素酶基因(UBQ)。应用qRT-PCR技术检测这6个候选内参基因在显齿蛇葡萄不同组织器官中(茎尖、嫩叶、成熟叶、老叶、茎和根)的表达情况。借助Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种统计学软件综合评价6个内参基因的表达稳定性。通过苯丙氨酸解氨酶基因(Ag PAL)的表达分析对筛选出的内参基因进行稳定性验证。结果 18 S-rRNA、GAPDH和Actin的表达稳定性较好,适合作为显齿蛇葡萄不同组织基因表达研究的内参基因,以这3个基因为内参基因分析Ag PAL基因的相对表达量,结果发现它们在各组织器官中的表达变化趋势基本一致。结论确定显齿蛇葡萄qRT-PCR分析的合适内参基因,为后续相关基因表达研究奠定基础。