活性口袋关键色氨酸对几丁质酶Chi304催化性质的研究

几丁质酶中存在结合口袋及水解活性位点,关键氨基酸与底物几丁质的结合可调控酶的水解活性。以嗜热几丁质酶Chi304为研究材料,采用同源建模分析其高级结构,发现在其底物结合口袋附近存在2个色氨酸(W140与W272),将其定点突变为丙氨酸后,采用高效液相色谱检测酶的水解产物,并进一步分析水解产物三乙酰壳三糖(DP_(3))与二乙酰壳二糖(DP_(2))的比例(DP_(3)/DP_(2)),用于评估突变体的效果。结果表明,突变体W140A、W272A与W140/272A水解胶体几丁质产物DP_(3)/DP_(2)分别较野生型提升23.3%、45.7%与80.0%。由此表明,W140与W272是影响酶与底物结合的关键氨基酸,将其突变为丙氨酸可提升Chi304的内切活力,降低外切活力。

抗虫的转AaIT基因杨树的获得

通过根癌农杆菌叶盘法将构建在双元载体上的昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至中国南方杨树N106(小叶杨×美洲黑杨,P.deltoides×P.simonii)中,共获得了62株再生植株。PCR分析及PCR产物Southernblotting的分析结果表明,AaIT基因整合在再生植株的基因组上。对部分转AaIT基因植株进行了杀虫实验,转基因植株A5对一龄舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫有明显的抗性,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因对照植株,其取食面积小,存活幼虫体重明显小于对照。ELISA分析证明了AaIT蛋白的表达。

中国甘蓝型油菜遗传多样性的RAPD分子标记

本文利用ＲＡＰＤ方法和统计学分析，对我国７省市和国外引进的总计４０份甘蓝型油菜品种的遗传多样性进行了研究。结果表明，４０个品种的甘蓝型油菜存在着广泛的遗传变异，根据ＲＡＰＤ指纹图谱，通过在ＤＮＡ分子水平上的聚类分析可以将它们分为３大类群，反映出这些品种之间的亲缘关系，并对如何引进甘蓝型油菜资源进行了初浅的讨论。

有机磷农药降解酶及其基因工程研究进展

有机磷农药是国内外使用最广泛的农药之一 ,为农业丰收做出了很大贡献。但是 ,有机磷农药具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能 ,对人存在着程度不同的毒性。有机磷农药降解酶可降解有机磷农药分子 ,破坏有机磷农药的磷酯键而使其脱毒。综述了有机磷农药降解酶及其特性 ,以及相关基因的分离克隆和基因工程研究进展。

链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达

从橄榄绿链霉菌StreptomycesolivaceoviridisA1中克隆出木聚糖酶基因xynA ,将带与不带原基因信号肽编码序列的xynA分别以正确的阅读框架克隆到大肠杆菌表达载体pET 2 2b(+)上的pellB信号肽编码序列之后 ,得到 2种构建的重组载体 ,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到了表达 ,表达产物具有生物活性。进一步将不带原基因信号肽编码序列的xynA插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中 ,转化毕赤酵母得到重组子 ,在重组子中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达 ,在摇床培养水平上的表达量达到 2 0 0mg L ,且表达产物具有生物学活性。

应用rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术对山羊瘤胃细菌多样性的研究

采用免培养的rpoB和16S rDNA基因的变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)对3种山羊(波尔山羊,内蒙古绒山羊,四川南江黄羊)瘤胃细菌优势菌群结构进行了比较分析。研究结果显示rpoBDGGE图谱中条带数目少于16S rDNA图谱,并且条带分离效果明显,更有利于分析瘤胃细菌群落组成。从两种DGGE图谱中均可以发现3种山羊瘤胃细菌具有一定的相似性,种内个体间相似性明显高于种间相似性,这说明寄主品种是影响瘤胃细菌种群构成的一个重要因素。同时进行了部分优势细菌16S rDNA基因V6-V8区序列的系统发育分析。基因序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有4条克隆的序列与基因库最相似菌的相似性大于97%,余下的克隆序列相似性在89%～96%之间,其中13条序列的与之相似性最高的序列均来自于未被鉴定的瘤胃细菌。

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因appA ,按照毕赤酵母 (Pichiapastoris)密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southernblotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了整合基因的拷贝数。Northernblotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS PAGE分析和表达产物的研究表明 ,植酸酶得到了高效分泌表达 ,在 5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到 2 5mg mL发酵液 ,酶活性 (发酵效价 )达到 7 5× 10 6 IU mL发酵液以上 ,大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。

杨树NL-80106转Bt基因植株的获得及抗虫性

通过根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)介导将苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis)毒蛋白基因Bt转入杨树NL 80 10 6 (美洲黑杨×小叶杨 ,Populusdeltoides×Populussimonii) ,获得了再生植株。PCR及PCR Southernblotting的分析结果表明 ,Bt基因已整合到基因组中。部分转基因植株的杀虫实验表明 ,转基因植株B45和B6 4对一龄舞毒蛾 (LymantriadisparLinn .)幼虫有明显抗性 ,饲喂转基因杨树叶片的幼虫死亡率显著高于未转基因的对照植株。

来源于Selenomonas ruminantium的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

应用酶解效率更高的高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的有效途径。根据毕赤酵母对于密码子的选择偏向,对来源于原核瘤胃微生物Selenomonasruminantium的高比活植酸酶基因phyS进行了密码子优化,将优化后的植酸酶基因phyS(m)与未优化的phyS插入到毕赤酵母转移载体pPIC9中,转化毕赤酵母得到重组子,在摇瓶水平上,phyS(m)的表达水平比phyS高10倍。在5L发酵罐中,优化后的植酸酶基因phyS(m)其蛋白表达量达到4mgml-1发酵液,效价达到1.6×106IUml-1,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。

表达Osmotin蛋白的转基因马铃薯对晚疫病的抗性分析

将缺失Ｃ端信号肽序列的Ｏｓｍｏｔｉｎ基因和在第９６位氨基酸处发生琥珀突变的Ｏｓｍｏｔｉｎ基因置于ＣａＭＶ双３５Ｓ启动子驱动下，转化马铃薯，获得ＮＰＴＩ抗性植株。经对２０株ＮＰＴＩ抗性植株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测和对５５株ＮＰＴＩ抗性植株的Ｎｏｕｔｈｅｒｎ分析，证实了Ｏｓｍｏｔｉｎ基因的插入和转录。对２１株转Ｏｓｍｏｔｉｎ基因和１７株转琥珀突变Ｏｓｍｏｔｉｎ基因植株的抗病性测定，分别筛选出８株和１０株抗病性与非转基因植株有显著差异（α＝００５）的转基因植株。对８株转Ｏｓｍｏｔｉｎ基因植株的ＤｏｔｂｌｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交分析，证明Ｏｓｍｏｔｉｎ蛋白胞外分泌能够赋予转基因植株叶片抗晚疫病的能力，研究结果暗示Ｏｓｍｏｔｉｎ蛋白具有抑菌活性的部位可能位于其Ｎ端。

我国部分白菜型油菜RAPD的研究

本研究用ＲＡＰＤ技术和统计学方法，对以湖南和湖北省油菜为主的３４个白菜型油菜品种的遗传多样性进行了分析。根据离差平方和，用Ｗａｒｄ’ｓ聚类方法进行聚类。结果表明：白菜型油菜的遗传变异与生态地理分布有密切的关系；湖南和湖北两省的白菜型油菜品种存在广泛的遗传变异；在ＤＮＡ水平上可将所分析的３４个品种分成８个类群。作者对研究结果在遗传育种中的应用进行了讨论。

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)抗虫转基因新疆杨的获得

利用根癌农杆菌介导法将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因导入新疆杨 (Populusal bavar pyramidalis) ,经筛选获得了大量转基因植株。对转基因植株经PCR鉴定、PCR Southern和点杂交分子检测结果证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。部分转基因植株的饲虫实验表明 。

枯草芽孢杆菌表达系统及其启动子研究进展

枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌,由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术,是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主,成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。而实现外源蛋白的高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子。目前,枯草芽孢杆菌中常用的启动子为组成型、诱导物诱导型、时期特异性及自诱导型。详细介绍枯草芽孢杆菌表达系统以及其常用启动子的优缺点,并对克隆新的启动子的方法做了总结,旨为完善枯草表达系统和工业生产外源蛋白奠定基础。

木聚糖酶XYNB的N46D突变、表达及酶学性质变化

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和同源序列比较,发现第11族木聚糖酶的催化结构域在β折叠股A3和B3之间存的一个保守的氨基酸位点,该位点与木聚糖酶的pH特性有关.据此设计了XYNB的N46D定点突变.将突变酶XYNBN46D在毕赤酵母中表达,表达的XYNBN46D经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNBN46D的最适pH值由5·2下降到4·2,pH稳定性也向酸性pH偏移,同时,热稳定性和最适温度也有一定的提高,但酶的比活性显著下降.结果证实,木聚糖酶XYNB的第46位Asn与其最适pH值相关.对导致酶学性质改变的可能因素进行了分析,结果为进一步的结构与功能研究提供了资料.

来源于橄榄绿链霉菌A1的高比活木聚糖酶XYNB的高效表达及性质的比较分析

高效表达高比活木聚糖酶是进一步提高木聚糖酶发酵效价、降低其生产成本的有效途径。将橄榄绿链霉菌 (Streptomycesolivaceoviridis)A1的高比活木聚糖酶成熟蛋白编码基因xynB克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中 ,转化毕赤酵母得到重组酵母 ,在重组酵母中木聚糖酶基因得到了高效分泌表达 ,且表达产物具有生物学活性。在 3L发酵罐中蛋白表达量约 1 4mg mL ,酶活性 (效价 )为 1 2 0 0IU mL。SDS PAGE分析表明 ,表达的木聚糖酶XYNBa为糖基化蛋白 ,分子量为 31kD ,经脱糖基化处理得到 2 1kD的XYNBb ,与橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB大小一致。通过对XYNB、XYNBa及XYNBb酶学性质的比较发现 :三者在比活性、Vmax及热稳定性方面有较大差异。该酶对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析表明 :酶解产物的主要成分为木二糖、木三糖和木四糖 ,占总糖含量的 95

我国芥菜型油菜品种遗传多样性初探

用RAPD技术对包括春、冬芥菜型油菜及国外品种在内的36个芥菜型油菜品种的遗传多样性进行了分析。在扩增得到的128条DNA带中,多态性DNA片段达88.28%。分析表明:春、冬油菜间遗传差异较大,国内冬性芥菜型油菜地方种多样性水平较高,25份冬性品种分属Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类群,而春性芥菜型油菜地方种均归于Ⅳ类;印度的RLM198与四川的珙县金黄油菜、澳大利亚品种与我国春油菜品种亲缘关系密切。

来源于酸热脂环酸杆菌的嗜酸性α-淀粉酶的表达研究

从嗜酸耐热的酸热脂环酸杆菌Alicyclobacillusacidocaldarius中克隆到α_淀粉酶的基因 (amy) ,该基因全长 390 3bp ,编码130 1个氨基酸 ,理论分子量约 14 0kD。将基因amy分别克隆到大肠杆菌E .coli表达载体pET_2 2b(+)和毕赤酵母P .pastoris表达载体pPIC9α ,并在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达 ,表达产物具有淀粉酶的活性。对酵母中表达的酶蛋白AMY进行了纯化 ,并初步研究了它的酶学性质 ,它的作用最适pH 3 2 ,在pH 2 5～ 4 6范围内 ,酶活性保留 5 0 %以上 ,它的最适温度 6 5℃ ,在 70℃下处理 30min ,酶活性维持 5 0 %以上 ,基本保留了天然酶蛋白的耐热性和嗜酸性。位于基因amy内部 +1174～+32 88bp的基因片段amy′全长 2 115bp ,编码 70 5个氨基酸 ,在E .coli表达后依然具有淀粉酶的活性。

抗菌肽构效关系及其表达策略研究进展

抗菌肽(antim icrobial peptides)是一类具有抗菌活性短肽的总称,广泛分布于原核生物与包括人类在内的真核生物体内,是宿主免疫防御系统中的重要组成部分。研究表明,抗菌肽除具有抗病毒、抗细菌、抗真菌作用外,还具有抗肿瘤作用。现从抗菌肽的结构特点与抗菌机制出发,对其构效关系及表达策略进行综述。

来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶基因lacO进行了分子改造。改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建得到重组毕赤酵母表达质粒。PCR检测、SDS—PAGE电泳分析和酶活力测定的结果表明，lacM基因已重组到酵母染色体上，并能正常分泌表达。与来改造的基因lacO的毕赤酵母重组子相比，酶蛋白表达量明显增加，约为改造前的3倍以上。

N13D、S40E点突变提高木聚糖酶XYNB的热稳定性

对来源于Streptomyces olivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模和序列比较,设计了N13D、S40E的定点突变,以期改善中温酶XYNB的热稳定性。突变酶N13D、S40E分别在毕赤酵母中表达,经纯化后与野生型酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,突变酶N13D和S40E在70℃处理5min,热稳定性比XYNB分别提高了24.76%和14.46%;突变酶N13D的比活性比XYNB提高了22%。在其他性质方面突变酶N13D、S40E与野生型酶XYNB基本相似。通过对木聚糖酶XYNB的定点突变,提高了该酶的热稳定性,并为结构与功能的进一步研究提供了材料。