代谢工程改造大肠杆菌生产肌苷

肌苷是一种具有重要生理功能的嘌呤核苷,被广泛应用在医药和食品领域。为构建肌苷工程菌株,该研究对阻断肌苷降解途径的大肠杆菌INO1-1进行了系统的代谢工程改造。结果显示,引入解淀粉芽孢杆菌的嘌呤操纵子和枯草芽孢杆菌来源的purF_(bsu)^(D293V,K316Q,S400W)突变基因,增强了肌苷合成途径,肌苷产量达到308.3 mg/L;将自身purA基因替换为枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)^(P242N)突变基因,弱化了腺苷合成支路,使肌苷产量提升至1412.5 mg/L;敲除purR基因及引入prs eco D128A突变基因,增强了前体物5-磷酸核糖-1-焦磷酸的供应,使肌苷产量提升至3.1 g/L;引入解淀粉芽孢杆菌的pbuE基因以促进肌苷外排,又敲除nupC基因以减弱肌苷吸收,使肌苷产量提升至5.0 g/L;最终菌株INO4-5经5 L发酵罐发酵48 h,肌苷产量达到20.2 g/L,糖酸转化率和生产强度分别为0.12 g/g葡萄糖和0.42 g/(L·h)。该研究从头构建了一株可稳定高效合成肌苷的工程菌株,为肌苷的发酵法生产提供了新的参考。

限氧发酵生产缬氨酸工程菌株及发酵过程优化

VHY18是之前构建的可在限氧条件下高产缬氨酸的菌株,但在发酵过程中会大量积累琥珀酸和乙酸,生长活力也会显著衰退,限制其发酵性能。为此,该研究首先敲除了VHY18中丙酮酸氧化酶和乙酸激酶编码基因poxB和ackA,构建了VHY19,使乙酸浓度降低了43.7%。接着敲除了VHY19的苹果酸脱氢酶编码基因mdh,构建了VHY20,使琥珀酸浓度降低了50.8%。最后优化了VHY20的双阶段发酵工艺,主要摸索了限氧发酵阶段的供氧条件、2个阶段的转换时机及葡萄糖流加速率。优化后的VHY20双阶段发酵工艺为,发酵开始时先进行好氧发酵,14 h后将好氧发酵转换至限氧发酵,并将供氧条件设置为搅拌转速400 r/min、风量2 L/min,补糖速率控制在25 g/h。菌株和发酵过程优化后,缬氨酸产量为90.4 g/L,转化率为0.53 g/g葡萄糖,分别较优化前提高了7.8%和30.5%;乙酸和琥珀酸的积累量分别为2.7和1.2 g/L,较优化前降低了76.9%和95.4%。