胃癌变前后凋亡相关蛋白和PCNA的表达

目的:探讨凋亡相关基因p53,Bcl-2和增生细胞核抗原(PCNA)在胃癌发生中的作用以及在胃癌早期诊断中的意义. 方法:采用免疫组化(LSAB)方法检测52例胃癌癌变前后组织标本的p53,Bcl-2和PCNA的表达. 结果:肠上皮化生、不典型增生和胃癌的p53蛋白表达分别为27.8%,38.2%和57.7%;Bcl-2蛋白表达分别为33.3%, 50.0%和65.4%;PCNA LI分别为41.4±13.0,47.9±8.9和53.0±11.9.在肠型胃癌,癌前p53,Bcl-2阳性者发展到癌时仍全为阳性,无1例转阴性;在弥漫型胃癌,癌前Bcl-2阳性者到癌时有1例转阴;PCNA LI由癌前发展到癌时明显增高,在肠型胃癌差异有显著性(P<0.001). 结论:在肠型胃癌发生发展过程中,p53,Bcl-2蛋白表达起重要作用,且细胞增生活性逐渐升高.

胃癌前病变演变过程中凋亡相关蛋白和PCNA的表达意义

目的:探讨凋亡相关蛋白P53、Bcl-2和增生细胞核抗原(PCNA)在胃癌前病变不同转归中的作用以及在胃癌早期诊断中的意义。方法:采用免疫组化(LSAB)法检测52例胃癌患者癌前病变组织标本及56例非胃癌患者组织标本的P53、Bcl-2和PCNA的表达。结果:发生癌变者与P53、Bcl-2和PCNA阳性强度有密切关系;PCNA标记指数(PCNA LI)在癌变组表达明显高于非癌变组,差异有显著性(t=5.261,P<0.01);在癌变组,88.5％的病例有单一或多种基因表达异常,51.9％为两种或两种以上基因同时表达,与非癌变组相比有显著性差异(x^2=4.393,P<0.05)。结论:在胃癌发生过程中,P53、Bcl-2表达强度明显增加,细胞增生活性升高,且为多基因协同作用,说明在胃癌演变过程中他们起重要作用。

兔抗胃癌相关蛋白GCRG213抗体的制备及鉴定

目的 :制备胃癌相关蛋白GCRG2 13的多克隆抗体。方法 :在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG2 13融合蛋白 ,并以所获蛋白免疫新西兰白兔 ,制备兔抗GCRG2 13的抗体。抗体的效价及特异性 ,分别用ELISA、Westernblot法鉴定。结果 :在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量 (Mr)约为 2 940 0的Thiore doxin/GCRG2 13融合蛋白 ,经凝胶回收法得到纯度近 10 0 %的蛋白产品。制备了兔抗GCRG2 13的抗体。ELISA法检测抗体的效价达到 1∶2 560 0 0 ,Westernblot证实该抗体可与原核表达的GCRG2 13蛋白特异性结合。结论 :兔抗GCRG2 13抗体的成功制备 ,为进一步深入研究GCRG2

胃癌相关基因GCRG213在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的 利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG2 13,制备高纯度的GCRG2 13蛋白。方法 采用PCR技术从pGEM T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG2 13cDNA序列 ,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体 pET10 2 /D TOPO中 ,转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导表达融合蛋白 ,凝胶回收目的蛋白。结果 SDS PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约 2 9 4kD的Thioredoxin/GCRG2 13融合蛋白。薄层凝胶扫描显示 ,其表达量占菌体总蛋白的 2 8 7%。经凝胶回收法得到纯度近 10 0 %的蛋白产品。结论 在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin/GCRG2 13融合蛋白 ,并制备出高纯度蛋白产品 。

抗人GCRG213单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备GCRG213单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法:在大肠杆菌中表达HIS-GCRG213融合蛋白,并以所获蛋白作为免疫原制备鼠mAb。采用ELISA、Westernblot法鉴定抗体的效价及特异性。免疫组化染色观察GCRG213在胃癌和正常组织中的表达。结果:HIS-GCRG213融合蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,经常规的细胞融合和筛选获得2株可稳定分泌抗GCRG213的杂交瘤细胞株。ELISA法检测腹水的效价可达到1∶106,Western blot证实该抗体可与重组HIS-GCRG213蛋白特异性结合。免疫组化染色显示GCRG213在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织。结论:成功地制备出2株抗GCRG213的mAb,为进一步研究GCRG213的生物学功能提供了有效的工具。

益生菌联合四联疗法治疗老年人幽门螺杆菌感染的临床观察

目的探讨益生菌在治疗老年人幽门螺杆菌(H.pylori)感染中的价值。方法入选2014年1月至10月解放军总医院南楼临床部消化内科120例老年H.pylori感染患者,根据年龄性别进行随机区组设计,分为益生菌治疗组和对照组,各60例。对照组给予阿莫西林+克拉霉素+雷贝拉唑+胶体果胶铋标准四联疗法,治疗组给予酪酸梭菌肠球菌三联活菌片+四联疗法,两组疗程均为14 d,治疗结束4周后复查^(13)C尿素呼气试验(^(13)C UBT),观察并比较两组患者H.pylori根除率及不良反应发生情况。结果 117例患者按方案完成治疗。治疗组和对照组按意向治疗(ITT)分析H.pylori根除率分别为83.33%和71.67%,按方案(PP)分析H.pylori根除率分别为86.21%和72.88%,治疗组ITT和PP根除率均明显高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),随访1年后复查,治疗组H.pylori根除率仍显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组不良反应发生率为10.34%,明显低于对照组的27.12%,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组对药物的耐受程度显著优于对照组(P<0.05)。结论益生菌联合标准四联疗法能有效提高H.pylori根除率,并且能显著降低药物不良反应。

胃癌相关基因GCRG213的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG2 13。方法 :采用PCR技术从pGEM T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG2 13cDNA序列 ,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体 pET10 2 /D TOPO中 ,转化大肠杆菌BL2 1,经IPTG诱导表达重组融合蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物。结果 :高效表达出相对分子量约2 9.4ku的重组融合蛋白。薄层凝胶扫描显示 ,其表达量占菌体总蛋白质的 2 8.7%。结论 :在大肠杆菌中成功表达了Thioredoxin GCRG2 13融合蛋白 ,为后续功能研究、蛋白制备及其抗体研制奠定了基础。

抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备及鉴定

目的制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体,为进一步深入研究其生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定基础。方法在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体。分别用ELISA、Westernblot法鉴定抗体的效价及特异性。结果在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约为16.8kD的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品。制备了抗GCRG224多克隆抗体。ELISA法检测抗体的效价达到1∶256000,Westernblot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合。结论成功地制备了胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体。

胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224. 方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF 的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG 诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物. 结果:高效表达出相对分子量约16800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.

抗人胃癌相关蛋白GCRG224多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备胃癌相关蛋白GCRG224的多克隆抗体。方法:在大肠杆菌中表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并以所获蛋白免疫新西兰白兔,制备抗GCRG224的多克隆抗体。ELISA、Westernblot法鉴定抗体的效价及特异性。免疫组化染色观察GCRG224在胃癌和正常组织中的表达。结果:在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约为16800的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品。制备了抗GCRG224多克隆抗体。ELISA法检测抗体的效价达到1:256000,Westernblot证实该抗体可与原核表达的GCRG224蛋白特异性结合。免疫组化染色显示GCRG224在胃癌组织中的表达明显强于正常胃黏膜组织。结论:GCRG224多克隆抗体的成功制备,为进一步深入研究GCRG224的生物学功能及其在胃癌发生发展中的作用奠定了基础。

GCRG224在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化

目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224,制备高纯度的GCRG224蛋白。方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达融合蛋白,凝胶回收目的蛋白。结果:SDS-PAGE证实在大肠杆菌中高效表达出相对分子量约16.8ku的Thioredoxin/GCRG224融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%。经凝胶回收法得到纯度近100%的蛋白产品。结论:在大肠杆菌中成功表达Thioredoxin/GCRG224融合蛋白,并制备了高纯度的蛋白产品,为后续功能研究及其抗体研制创造了条件。

胃癌相关基因GCRG123的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG123.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG123cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:工程菌经IPTG诱导后,高效表达出相对分子质量约18700的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的23.6%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG123重组融合蛋白.

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响

目的研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3·1(+)。测序正确的重组子pcDNA3·1-a(含GCRG213正向克隆)、pcDNA3·1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Westernblot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,AnnexinVFITC/PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3·1(+)。与对应的空载体比较,转染pcD-NA3·1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35·4%,蛋白的表达上调49·4%,而转染pcDNA3·1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32·1%,蛋白的表达下调50·3%。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。

胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．方法:从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性内切酶KpnI,BamHI和EcoRI, BamHI识别位点．按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3．1(+)．测序正确的重组子pcDNA3．1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3．1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用半定量RT-PCR及Wlestern blot比较转染不同质粒的 MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异．结果:经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体 pcDNA3．1(+),组成重组子pcDNA3．1-a(含正向克隆),pcDNA3．1-b(含反向克隆)．重组子 pcDNA3．1-a,pcDNA3．1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株．与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示转染pcDNA3．1-a的 MKN45细胞中其mRNA的表达上调35．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其mRNA 的表达下调32．1％;Western blot结果显示转染 pcDNA3．1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50．3％．结论:成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．

胃癌相关基因GCRG 213正反义表达重组腺相关病毒载体的构建

目的构建胃癌相关基因OCRG 213正、反义表达重组腺相关病毒载体,制备相应的重组腺相关病毒。方法通过引入限制性内切酶识别位点从pGEM-T质粒上扩增出胃癌相关基因GCRG 213的DNA片段,按正、反向克隆入pCMV-MCS载体,测序正确后用NotI酶切,克隆入pAAV-MCS载体,单、双酶切鉴定后,同pAAV-Helper、pAAV- RC质粒用磷酸钙转染法共转染AAV-293细胞制备病毒。结果成功构建包含胃癌相关基因GCRG213正、反义克隆的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为4×1010v．g．／ml腺相关病毒。结论载体的构建和病毒制备为进一步研究GCRG 213的体内功能打下了基础。

胃癌相关蛋白GCRG213在胃癌细胞中特异性表达

目的:观察来源于胃癌高表达基因GCRG213抗体在两种不同细胞的表达情况,评价GCRG213抗体的肿瘤特异性. 方法:应用免疫印迹方法对GCRG213抗体在胃癌细胞SGC-7901和胃上皮细胞HFE-145的表达进行比较分析. 结果:GCRG213抗体与胃癌SGC-7901细胞蛋白免疫结合后在相应大小位置有一清晰的特异性条带,而与胃上皮HFE-145细胞蛋白免疫结合后则无特异性条带出现, GCRG213抗体与两种细胞蛋白的结合存在明显差异. 结论:GCRG213抗体具有很强的肿瘤特异性.

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞成瘤性的影响

目的:研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45成瘤性的影响。方法:采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果:平板克隆形成实验显示转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞其细胞克隆形成数量高于转染空载体的细胞,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞其细胞克隆形成数量低于转染空载体的细胞。在裸鼠体内进行的转染细胞的成瘤性实验可见,转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞在裸鼠体内成瘤性高于转染空载体的细胞,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞在裸鼠体内成瘤性低于转染空载体的细胞。结论:胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的成瘤性,GCRG213反义转染可抑制肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞的成瘤性。

胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响

目的研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。结果GCRG213正向和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率。结论胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素。

胃癌相关基因GCRG213正反向转染和RNA干扰对裸鼠胃癌种植瘤的影响

目的:观察胃癌相关基因GCRG213体内正、反向转染和RNA干扰对裸鼠胃癌种植瘤的影响.方法:将对数生长期的胃癌细胞株MKN45接种到裸鼠皮下,成瘤后用制备好的分别含GCRG213正、反义克隆和RNAi片段的腺相关病毒分别在肿瘤局部注射,以空病毒和生理盐水对照,继续喂养2 wk后处死,取肿瘤测量重量,并用半定量RT-PCR检测肿瘤组织GCRG213mRNA表达水平.结果:裸鼠接种MKN45细胞3 wk左右皮下形成肿瘤结节.肿瘤组织重量在正向转染组为5.12±1.02g、反向组1.22±0.46g、RNAi组0.81±0.37g、空病毒组3.13±0.69g、生理盐水组3.45±0.87g;各组GCRG213 mRNA表达水平依次分别为0.406±0.01 3,0.211±0.021,0.087±0.015,0.312±0.050,0.283±0.061.结论:三种腺相关病毒分别有效地介导了GCRG213正、反义克隆和RNAi片段的体内表达,提高或降低了GCRG213 mRNA的表达水平,促进或抑制了胃癌种植瘤的生长.