非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具有良好的免疫原性,小鼠血清抗体效价为1∶12800。本研究建立的ELISA方法(p22-ELISA)的最佳抗原包被浓度为0.125μg/孔,最佳待检血清稀释度为1∶800,最佳酶标二抗稀释度为1∶10000;阴阳性临界值为0.384;与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等抗体阳性猪血清无交叉反应,说明特异性好;批内与批间变异系数均低于10%,表明重复性好。利用p22-ELISA方法检测了263份临床猪血清样品,与商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒的符合率为97.7%。【结论】本研究基于原核表达的p22截短体蛋白建立了用于检测ASFV抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ASFV感染诊断和流行病学调查提供了技术支撑。

纤维素酶枯草芽孢杆菌表达系统及其发酵黄芪的研究

纤维素酶对纤维素有较强的分解作用,自然界存在的产酶菌株一般存在产酶效率低、酶活性不稳定等缺点,难以在畜牧业生产中大量推广使用。本研究选取编码纤维素酶的主效基因Cel9A作为目的基因,以枯草芽孢杆菌WB800N为宿主,通过基因克隆、电转化等方法,构建重组菌株WB800N/PHT43-Cel9A。筛选高效产酶菌株,发酵黄芪以显著提高多糖产率。本研究为黄芪、农产品秸秆等天然植物多糖在畜牧业的推广应用以及农业环境控制提供技术贮备。