鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔法基因转移体系的建立

体内电穿孔法转基因技术作为一种新型有效的转基因方法,被广泛应用于发育生物学的研究,特别是中枢神经系统发育。本研究旨在通过子宫内电穿孔法,建立鼠胚大脑皮层体内基因转移体系:将带有GFP的表达载体pCAGGS-IRES-EGFP显微注入胚胎期14.5d的鼠胚侧脑室中,电极沿与脑中缝平行的方向夹持鼠脑,在电压30V,脉冲时间50ms,脉冲数5的条件下方波电击,将外源基因转移到室管膜层细胞。胚胎被重新放回母体内,继续发育3d。分离被转染的鼠胚脑组织,沿冠状面冰冻切片,在荧光显微镜下观察到外源蛋白GFP在鼠胚大脑皮层中的瞬时表达。鼠胚大脑皮层子宫内电穿孔法基因转移体系的建立将为进一步研究皮层发育、神经元迁移、轴突导向等以及神经发生过程中相关基因功能奠定基础。

粘着斑激酶的原核表达、纯化及抗体的制备

粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是细胞质内单亚基非受体型酪氨酸激酶,通过各种信号途径参与调节细胞生长、发育、黏附、细胞骨架重组、转化、扩散和迁移等过程.采用PCR方法,从Flag-FAK质粒中克隆编码FAK C端273个氨基酸的基因片段,构建FAK融合蛋白原核表达载体pET28a(+)/FAK,进行原核表达与蛋白纯化,取纯化的FAK蛋白免疫小鼠,制备FAK抗血清.结果表明构建的表达FAK C端功能结构域的原核表达质粒pET28a(+)/FAK,经过BL21(DE3)大肠杆菌表达、镍亲和层析柱纯化,获得相对分子质量约33 kDa的融合蛋白,并利用小鼠制备了多克隆抗体,EL ISA检测显示该抗体有较高效价.荧光免疫结果显示此多克隆抗体与FAK蛋白特异性结合,为进一步研究神经细胞中FAK的作用机制奠定了基础.

植物转录后基因沉默抑制蛋白研究进展

转录后基因沉默现象广泛存在于植物、动物和真菌中。在植物中转录后基因沉默现象是对外来病毒入侵的一种防御机制。植物病毒既是转录后基因沉默的起始物、靶目标,又是编码抑制转录后基因沉默的蛋白。已经发现3种病毒抑制子作用于转录后基因沉默的不同阶段:烟草蚀刻病毒蛋白(HC-Pro)作用于转录后基因沉默的持续阶段,产生25 nt小RNA的上游和产生沉默信号的下游区域;马铃薯X病毒蛋白(P25)和黄瓜花叶病毒蛋白(CMV2b)作用于转录后基因沉默的信号阶段。

植物病毒沉默抑制子P25的原核表达及纯化

通过体外DNA重组技术将P25基因连接在pET28a(+)载体上,构建成重组质粒。经PCR扩增、酶切鉴定及DNA序列分析,融合的P25基因序列正确。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行异丙基-βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经过亲和层析得到纯品目的蛋白P25。