家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L^(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L^(-1)。在20 mmol·L^(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L^(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L^(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。

家蚕bHLH转录因子Bmdimm与Bmchip的相互作用

【目的】bHLH转录因子Bmdimm是家蚕(Bombyx mori)5龄后期调控蚕丝蛋白丝素重链基因表达的重要转录因子。分析发现Bmdimm蛋白中包含有可能发生泛素化修饰的赖氨酸残基K43,因此推测Bmdimm可能发生泛素化修饰而被降解。Bmchip属于家蚕泛素连接酶E3家族中的U-box亚家族,在家蚕5龄期后部丝腺中有表达。论文旨在明确Bmdimm与Bmchip之间的相互作用,以便于更好地理解Bmdimm在家蚕体内的泛素化修饰及其对丝素重链基因转录调控的生物学意义。【方法】利用家蚕各组织基因芯片表达谱分析Bmdimm和Bmchip在后部丝腺中的表达情况;分别通过PCR和基因合成获得Bmdimm和Bmchip的CDS序列,将其构建到不同的原核表达载体并转化大肠杆菌表达目的蛋白,筛选最优的表达条件;利用镍柱亲和层析纯化融合蛋白,加入蛋白酶酶切,并再次通过镍柱亲和层析去除融合标签,纯化Bmdimm和Bmchip蛋白;利用凝胶过滤层析分析Bmdimm和Bmchip在溶液中的聚集状态;利用圆二色光谱研究Bmdimm和Bmchip蛋白的二级结构;利用Far-western blotting和Pull-down研究Bmdimm和Bmchip在体外的相互作用;利用微量热泳动研究Bmdimm和Bmchip结合的亲和力。【结果】基因芯片表达谱揭示Bmdimm和Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中都有表达。构建了Bmdimm和Bmchip多种表达载体,发现ppSUMO-Bmdimm和pET-32M·3C-Bmchip表达载体在16℃,0.3 mmol·L^(-1) IPTG诱导下表达最好,并以此为基础表达纯化了Bmdimm和Bmchip蛋白;凝胶过滤分析表明Bmdimm和Bmchip蛋白在溶液中主要以二聚体的形式存在;圆二色光谱显示Bmdimm和Bmchip蛋白都含有α-螺旋结构;Far-western blotting和Pull-down结果表明Bmdimm和Bmchip可以在体外结合;利用微量热泳动实验计算出Bmdimm和Bmchip结合的平衡解离常数为(750±28.6)μmol·L^(-1)。【结论】家蚕bHLH转录因子Bmdimm和泛素连接酶Bmchip在家蚕5龄期后部丝腺中均有表达,二者可以在体外发生瞬时相互作用,暗示了Bmdimm可能通过Bmchip介导发生泛素化修饰从而下调丝素重链基因的转录。

家蚕bHLH转录因子Bmsage可溶性表达、纯化与结构分析

碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子在生命活动过程中发挥着重要的调控作用。Bmsage是家蚕丝腺中高量表达的一类bHLH转录因子,不仅参与了丝腺细胞在胚胎期的发育调控,而且对蚕丝蛋白的合成也有至关重要的调控作用,然而当前对其性质和结构了解不多。为研究其性质、结构和生物学功能,构建了NusA、MBP、SUMO、Trx和His融合标签的Bmsage重组原核表达载体,通过改变诱导温度和IPTG浓度,确定了Bmsage在大肠杆菌中可溶性表达的最佳载体和表达条件,进而通过镍柱亲和层析纯化获得了Bmsage,利用圆二色光谱研究了其二级结构。结果表明,NusA与MBP标签可显著增强Bmsage在大肠杆菌中的可溶性表达,但难以与Bmsage分离。SUMO标签有一定的助溶效果,并且能够与Bmsage有效分离。其他标签对Bmsage可溶性表达的效果不明显。圆二色光谱分析表明Bmsage含有α-helix结构,推测SUMO标签可能促进了Bmsage折叠形成类天然的结构。这些工作为深入研究Bmsage的性质、结构与功能建立了基础,同时也为其他类似蛋白的表达纯化提供了参考。

家蚕精氨酸激酶原核表达纯化、结构与活性分析

精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内能量代谢的关键酶,在生长发育、营养利用、免疫抗性、胁迫应答等生命活动过程中发挥着重要的调控作用。家蚕精氨酸激酶BmAK与能量平衡、抗NPV病毒过程相关,但目前关于其分子结构和酶学性质的研究不多。克隆了BmAK基因ORF序列,分析了其染色体定位、基因组结构、mRNA结构、二级结构和三级结构。进化分析表明AK在进化过程中高度保守。原核表达获得了可溶性的BmAK重组蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化了BmAK。圆二色光谱分析显示BmAK包含α螺旋结构,其α螺旋结构在pH 5–10范围内相对稳定。酶活分析表明BmAK的最适温度为30℃,最适pH为7.5。25℃时BmAK的催化活性最大,在15–30℃范围内,BmAK的结构相对稳定,活性差别不大。BmAK的结构在pH 7.0左右相对稳定。这些研究为揭示BmAK的结构和功能提供了基础,有助于开发以AK为分子靶标的绿色安全环保的新型杀虫剂。

家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。

2023年河南省人类免疫缺陷病毒1型感染者治疗前耐药特征分析

目的监测河南省2023年未接受抗反转录病毒治疗(ART)的人类免疫缺陷病毒(HIV)-1感染者HIV-1基因亚型分布和治疗前耐药突变情况,为了解河南省HIV-1耐药株传播和制订ART方案提供数据支持。方法收集2023年1月至12月于郑州市第六人民医院就诊的未接受ART的HIV-1感染者的临床资料和耐药情况。本研究为横断面研究。采集患者血浆样本,通过反转录-巢式聚合酶链反应扩增HIV-1部分pol区基因序列及整合酶基因序列。通过REGA HIV-1亚型分析工具确定HIV-1分离株的亚型,使用美国斯坦福大学HIV耐药数据库对其基因耐药突变和抗病毒药物敏感性进行分析。结果1073例未接受ART的HIV-1感染者中,1042例患者的样本被成功扩增,扩增成功率为97.11%,共检测到12种HIV基因亚型,构成比前5位的亚型依次为流行重组型(CRF)07BC[43.76%(456/1042)]、CRF01AE[25.91%(270/1042)]、B[20.92%(218/1042)]、CRF5501B[5.28%(55/1042)]和CRF08BC[1.25%(13/1042)]。HIV-1感染者ART前总耐药突变率为28.89%(301/1042)。其中非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTI)耐药突变率为20.92%(218/1042),核苷类反转录酶抑制剂(NRTI)为4.03%(42/1042),蛋白酶抑制剂(PI)为3.84%(40/1042),整合酶抑制剂(INSTI)为2.98%(31/1042)。V179位点[12.96%(135/1042)]是最常见的NNRTI相关突变位点,M184位点[2.40%(25/1042)]是最常见的NRTI相关突变位点,Q58[2.78%(29/1042)]和E157[1.44%(15/1042)]位点分别在PI和INSTI相关突变位点中最为常见。结论河南省未接受ART的HIV-1感染者基因亚型分布呈多样化,耐药率呈中度流行水平,应继续加强ART前耐药的密切监测。