高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株的核苷酸序列与古典美洲株的核苷酸序列,设计一对高致病性PRRSV特异性引物,结合快速的RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立高致病性PRRSV快速RT-PCR检测体系。通过测序和同类试剂盒检测效果比对,证实该体系检测结果准确,体系特异性和灵敏度试验结果显示,该体系对猪瘟病毒、普通PRRSV、禽流感病毒无扩增产物,至少能检测经10万倍稀释后的临床阳性样品。该方法可直接对可疑组织样品进行检测,操作简单、快速、价廉、受环境因素污染概率小,适合临床样品的检测。

3株猪红斑丹毒丝菌湖南株的分离与鉴定

从湖南3个不同地区的临床疹块型猪病病例中,分离获得3株能在2 d内致死小白鼠,1～4 d内致死鸽的革兰氏阳性菌,生化鉴定和16S rDNA PCR测序鉴定结果显示3株分离菌均为猪红斑丹毒丝菌,药敏试验显示,3株猪红斑丹毒丝菌均对青霉素等耐药,对恩诺沙星等敏感。

小反刍兽疫病毒野毒与疫苗毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

对GenBank中的小反刍兽疫野毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)及疫苗毒株的基因序列进行分析,设计两对引物和两条特异探针,建立小反刍兽疫病毒野毒与疫苗毒株的双重荧光RT-PCR鉴别检测方法。特异性检测表明,建立的双重荧光RT-PCR方法,可特异检测野毒(FAM通道)和疫苗毒(VIC通道)。灵敏度实验表明,FAM通道可检测到10^(-5)稀释度的RNA(3.576 ng/mL),VIC通道可检测到10^(-3)稀释度的RNA(27.6 ng/mL)。重复性实验表明,该双重荧光RT-PCR方法重复性较好。用建立的二重荧光RT-PCR方法对20份组织样品进行检测,结果显示,该方法可以有效区分野毒和疫苗毒株,且野毒检测结果与实验室确诊阳性结果一致,可以用于临床检测。

五种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的比较

目的研究Trizol RNA提取法、杭州博日吸附柱RNA提取法、Promega核酸提取仪磁珠RNA提取法、西安天隆核酸提取仪磁珠RNA提取法、Thermo核酸提取仪磁珠RNA提取法等五种不同核酸提取方法对不同含量猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性样品的相对提取效率,为动物疫病监测诊断实验室核酸提取方式的选择提供技术参考。方法用五种不同核酸提取方法对4份10倍梯度稀释的PRRSV阳性血清、2份PRRSV阳性组织悬液及其离心后的上清液共8份样品同时进行核酸提取,用荧光RT-PCR方法进行检测,获取各样品PRRSV荧光RT-PCR结果的CP值,分析五种提取方式的相对提取效率。结果对合适的提取样品,磁珠提取法相对提取效率最高,吸附柱法其次,Trizol提取法相对效率较差;在三种磁珠提取法中,提取效率相差在2个CP值内,差异不明显,但以天隆磁珠提取法提取效率更高。结论预装试剂结合仪器自动化操作的磁珠法提取效果稳定,效率最高;国产仪器国产试剂提取效率不亚于进口仪器和试剂。

2001-2008年湖南省猪群疫病流行情况分析

对近8年来接诊的1424个场次不完全诊断的临床猪病例进行统计,分析近年来猪群疫病的发生流行情况。结果显示,猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型感染、猪伪狂犬病是湖南省猪群的主要传染病;猪群疫病高发期可能是每年的6—9月;病例多集中在饲养量大和交通比较方便的区域;多重感染病例多,其中,猪圆环病毒2型的多重感染率最高。

湖南省部分屠宰场非洲猪瘟监测

为了解屠宰场非洲猪瘟病毒(ASFV)污染情况,评估其潜在传播风险,2018年10月,在湖南省86个屠宰场采集样品895份,使用荧光PCR方法进行ASFV核酸检测。结果显示,11个屠宰场的43份样品呈ASFV核酸阳性,场阳性率为12.8%,样品阳性率为4.8%。调查分析表明,ASFV阳性屠宰场与是否屠宰过来自疫点的生猪及场内环境、工具、车辆的消毒情况相关。调查提示,屠宰场应继续加大ASFV自检力度,政府和主管部门需继续加强检疫监管,以降低ASF扩散风险。

2016年湖南省规模猪场主要病毒性疫病流行情况分析

对2016年湖南省规模猪场送检的117例临床病例进行实验室诊断和流行病学分析。结果显示:各送检临床病例中,以哺乳仔猪、保育猪、育肥猪发病较多;临床表现以呼吸道症状和腹泻症状多见;病毒性疾病的比例达86.3%,其中圆环病毒2型(PCV2)、蓝耳病病毒(PRRSV)的检出率较高,多重病原感染比例达57.4%。结果表明,2016年湖南省猪病主要以PCV2、PRRSV等引起的病毒性疫病为主,且普遍存在多病原感染现象。

猪圆环病毒2型湖南株的分离与序列分析

为了解湖南省猪群中猪猪圆环病毒2型（PCV-2）的流行变异情况，从2003年-2008年湖南省疑似PMWS病死猪组织中分离获得7株PCV-2流行毒株，分别命名为HuN-03、HuN-05、HuN-0601、HuN-0602、HuN-0701HuN-0702、HuN-08。用PCR方法对这7株病毒进行全基因扩增及测序分析。结果显示，7株PCV-2分离株基因组全长均为1767bp，有典型的PCV-2基因组结构；病毒毒株间同源性在94．9％～99．3％之间，与GenBank中的13株PCV-2基因组同源性在93．6％～99．7％之间，与2株PCV-1亲缘关系较远，同源性只有75．7％～76．5％；在遗传演化关系上，7株分离株分属4个进化方向，HuN-0601可能是外来毒株，HuN-03在一个独立的进化方向内，可能是其他5株病毒的母源性毒株，其他5株病毒可能代表了两个遗传种群，一个是国际流行稳定毒株，一个是国内地域性流行毒株。

湖南省部分地区病猪和屠宰猪群猪圆环病毒感染状况调查

为了解湖南省猪圆环病毒(PCV)流行情况,采用荧光PCR方法,对来自湖南省14个市州的821份临床病料和屠宰场猪淋巴结样品进行PCV1、PCV2、PCV3和PCV4荧光PCR检测。结果显示:在821份样品中,PCV阳性检出率为88.06%(723/821),阳性检出率由高到低依次为PCV2(81.49%)、PCV3(33.98%)、PCV1(8.04%)和PCV4(1.10%);278个样品存在两种及以上的PCV混合感染,以PCV2+PCV3混合感染最多,占82.01%;在地域分布上,PCV1、PCV2、PCV3在湖南省各地区均有分布,而PCV4分布范围较小,感染率低。结果表明,湖南省内PCV流行较为普遍,4种基因型病毒都存在,但以PCV2流行最为广泛,需要加强防控。

2011—2015年环洞庭湖区H3亚型禽流感病毒的分离鉴定与遗传演化

为了解环洞庭湖地区家禽H3亚型禽流感病毒的感染情况和进化规律,笔者对2011—2015年湖南省环洞庭湖地区的多个活禽市场与散养鸭场分离的31株H3亚型禽流感病毒进行基因测序和进化分析。结果表明:所有病毒的HA裂解位点不含连续的碱性氨基酸,为低致病性禽流感病毒的分子特征;各基因片段进化树显示部分病毒的PA与PB2基因与H5在相同分支,部分病毒的NP、PA、PB1与H7处于相同分支,表明H3可能与H5、H7亚型的禽流感病毒发生了复杂的基因交换;散养家禽分离的部分H3亚型禽流感病毒内部基因与越南、韩国等周边国家野鸟源的H3、H6、H7、H11等亚型同源性较高,可能有相同的进化来源。进一步将分离的病毒进行全基因比对,可划分出21种不同的病毒基因型。环洞庭湖地区H3亚型禽流感病毒基因来源复杂,表现出明显的遗传多样性。

重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型Re-6株)对散养鸭免疫效果的研究

为评估政府采购重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型Re-6株)对水禽的临床免疫效果,在县级疫苗储备库中,选取6家企业生产的重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型Re-6株)免疫散养鸭,结果显示,试验疫苗免疫安全性良好,能产生明显的免疫反应,除有1家企业疫苗效果较差外,其他5个企业生产的疫苗对鸭免疫效果良好,免疫接种后最早14d即产生合格抗体,免疫有效期最长达151d以上。

湖南省2015～2017年主要活禽批发市场低致病性禽流感病毒监测情况

为了解湖南省主要活禽批发市场低致病性禽流感病毒的流行情况,将采集的拭子样品接种鸡胚培养后,进行病毒分离,并结合血凝抑制试验和RT-PCR鉴定禽流感病毒的亚型。结果显示:在2015～2017年采样的3 208份拭子中分离出397株低致病性禽流感病毒,总分离率为12.37%,其中环境拭子中的低致病性禽流感病毒的分离率最高,达22.22%,其次是鸭拭子为11.62%,鸡拭子为10.70%。本试验共分离出H1、H3、H4、H6、H9、H10和H11共7种亚型的低致病性禽流感病毒,其中H9、H6和H3亚型分离率分别达到6.51%、2.21%和1.96%。监测表明:湖南省活禽批发市场中低致病性禽流感病毒隐性感染情况普遍存在。

小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的病毒分布

为了解小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内的分布情况,平行采集临床发病羊的脾脏、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、大肠、淋巴结以及眼拭子、鼻拭子、肛门拭子、血清等样品,应用荧光RT-PCR方法对各样品进行平行检测,比较各样品检测Ct值,评估病毒分布和各样品中的病毒含量,结果显示,所有样品小反刍兽疫病毒核酸均为阳性,其中大肠、肺脏、脾脏和淋巴结的检测Ct值较小,表明小反刍兽疫病毒在自然感染羊体内呈全身分布,但在大肠、肺、脾和淋巴结等组织中的含量较高。

湖南省10株猪圆环病毒3型的测序与遗传进化分析

为了解湖南省猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以25份PCV3阳性样品DNA为模板,使用PCR方法分两段扩增PCV3全基因序列并进行拼接。结果获得7株PCV3分离株全基因组,3株PCV3 ORF2序列。7株PCV3全基因组的核苷酸序列同源性为98.8%~99.7%,10株ORF2的核苷酸序列同源性为97.8%~99.8%。根据系统发育树,PCV3可分为3个分支,所有分离株的遗传关系均较近。ORF2氨基酸序列突变少,发现2个在其他参考毒株中未出现的突变位点。研究获得的PCV3毒株序列与国内外PCV3毒株序列其遗传关系较近,无特殊突变,较为稳定。

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了1对扩增σC蛋白基因的引物,对mDRVZJ99株的RNA抽提物进行RTPCR扩增,获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序,序列经同源性比较,发现mDRVZJ99株σC蛋白基因序列与福建MW9710株对应基因的同源性为99.5%,与法国89026株对应基因的同源性为94.2%,与法国89330株对应基因的同源性为95.0%;相应的氨基酸序列同源性分别为98.9%、94.1%、93.7%。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果,与国外学者对mDRVσC蛋白的报道相似。

湖南省首例非洲猪瘟病例的确诊与监测分析

2018年10月,湖南省桃江县在疫情排查时发现一猪场生猪出现不明原因死亡情况,经临床调查和采样检测,最终被国家外来动物疫病研究中心确诊为非洲猪瘟(ASF)疫情,随后当地政府在农业农村部的统一领导下采取了一系列防控措施,疫情得到有效控制,并在2018年12月初解除封锁。现就本次疫情的确诊和流行病学调查结果进行阐述,期望为非洲猪瘟防控提供参考。

重组禽流感病毒二价灭活疫苗（H5+H7）对鸸鹋免疫效果的研究

为评估重组禽流感病毒二价灭活疫苗(H5 Re-8株+H7 Re1株)疫苗对鸸鹋的免疫效果,将55日龄鸸鹋分组后按规定程序进行免疫,定期采集并分离血清,检测H5、H7亚型禽流感病毒的HI抗体滴度。结果显示:免疫前鸸鹋血清H5与H7的HI抗体滴度均低于1 log2,首免后14 d,H5亚型和H7亚型HI抗体平均滴度分别达到5.9 log2与5.3 log2,免疫后49 d,H5与H7亚型HI抗体滴度达到最高,分别为8.4 log2与10.0 log2。试验疫苗免疫安全性良好,免疫组鸸鹋能产生明显的免疫反应,加强免疫后抗体有效期最长可达189 d以上。本试验结果为鸸鹋免疫禽流感疫苗提供参考依据。

一例野猫引发猪弓形虫病的诊断和治疗

弓形虫病又称弓浆虫病或弓形体病,主要以高热、呼吸及神经症状、繁殖障碍为主要特征,是一种世界性分布的人兽共患的寄生性原虫病,在家畜和野生动物中广泛存在。该病是养猪业的一大顽症,危害性很大,猪场暴发弓形虫病时,发病率可达100%,死亡率高达60%以上。

5株湖南猪圆环病毒1型全基因组测序与遗传进化分析

为了解湖南猪群猪圆环病毒1型(PCV1)的遗传变异情况,以PCV1阳性DNA为模板,使用PCR方法分两段扩增PCV1全基因序列并进行拼接。结果共获得5个PCV1全基因组,其中3株全基因大小为1759 bp,另外2株分别为1758 bp和1760 bp。5株全基因组同源性为98.4%~99.7%,与国内外的PCV1全基因组同源性为98.1%~99.7%;ORF2序列同源性为97.6%~99.6%,与国内外的PCV1 ORF2同源性为96.1%~99.9%。系统发育树显示,5株PCV1均属于同一分支,并显示出一定的地理差异,但差异较小。结果表明,湖南省流行的PCV1毒株基因较为稳定,分离株间差异较小。本研究为湖南省猪圆环病毒病防控及相关研究奠定了基础。