Bag3 P215L基因突变小鼠的繁殖与基因型鉴定

BAG3是一种多功能蛋白,在多种疾病的发生发展中起决定性作用.临床研究表明,BAG3蛋白的第209位残基脯氨酸到亮氨酸p. Pro209Leu (c. 626C > T)的杂合子突变能够引起一种罕见的肌原纤维肌病.为进一步研究BAG3 P209L突变引起的相关疾病,建立了Bag3 P215L突变的小鼠模型(小鼠的Bag3蛋白序列中对应突变的脯氨酸位于第215位残基上).将Bag3 P215L杂合突变的雄鼠和雌鼠进行繁殖交配,将得到纯合子、杂合子及野生型3种基因型小鼠.出生后3~4周龄的小鼠剪尾,采用了NaOH法、KCl法和改良SDS法共3种方法提取基因组DNA,然后进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳和DNA测序.用改良SDS法能更为稳定有效地提取DNA,从而成功进行Bag3 P215L小鼠的繁育和基因型鉴定.为进一步研究BAG3 P209L突变引起的相关疾病提供了理想的动物模型.

CHAC1基因沉默SU-DHL-8细胞株的构建及其对青蒿素细胞毒活性的影响

应用慢病毒短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)转染的方式构建了阳离子转运蛋白样蛋白1(cation transport regulator-like protein 1,CHAC1)基因沉默SU-DHL-8细胞株模型,用于研究CHAC1基因对青蒿素细胞毒活性的影响.研究了青蒿素对弥散性大B细胞淋巴瘤SU-DHL-8细胞增殖的抑制作用及作用后CHAC 1基因及蛋白的表达情况.应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默SU-DHL-8细胞株内的CHAC1基因.采用慢病毒转染的方法构建CHAC1基因沉默的SU-DHL-8细胞株.采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(real-time quantitative PCR detecting system,qPCR)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)活性测定法和蛋白免疫印迹(Westen blot)的方法检测沉默效果以及CHAC1基因对青蒿素细胞毒活性的影响.成功构建了稳定沉默CHAC1基因的稳转细胞株,并初步探讨了CHAC1基因对青蒿素抑制弥散性大B细胞淋巴瘤SU-DHL-8细胞增殖的影响.

白藜芦醇通过调控HIF-1α/NOX4/ROS通路抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞氧化应激与增殖

本文旨在明确白藜芦醇对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs)氧化应激与增殖的作用及分子机制。体外分离培养原代大鼠PASMCs,采用不同浓度的白藜芦醇(10、20和40μmol/L)或NADPH氧化酶(NADPH oxidases, NOXs)抑制剂VAS2870 (10μmol/L)预处理0.5 h,然后将细胞置于常氧(21%O2, 5%CO2)或低氧(2%O2, 5%CO2)中培养24h。采用CCK-8法和增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的表达水平检测细胞增殖,用DCFH-DA测定细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)的生成,用real-time RT-PCR和Western blot检测NOX1、NOX4和低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α)的表达水平,通过小干扰RNAs (small interference RNAs, siRNAs)特异性沉默Hif-1α和Nox4后确定相关信号通路。结果显示,白藜芦醇和VAS2870均能显著抑制低氧诱导的大鼠PASMCs细胞增殖和ROS生成,同时白藜芦醇还能有效阻止低氧诱导的HIF-1α蛋白的聚集和NOX4的表达上调,而对NOX1没有明显的影响。沉默Hif-1α或Nox4后,低氧诱导的大鼠PASMCs细胞增殖和ROS累积均显著降低,且能被白藜芦醇进一步抑制。上述结果提示,白藜芦醇可能通过阻断HIF-1α/NOX4/ROS信号通路抑制低氧诱导的大鼠PASMCs氧化应激和增殖。