苦参碱对K562细胞早期原癌基因表达的影响

背景与目的:苦参碱具有抗癌活性,我们前期的研究也证明苦参碱对K562细胞有增殖抑制与诱导分化作用。但苦参碱诱导K562细胞多向分化的分子机制尚不清楚。我们拟对其分子机制进行初步研究。方法:采用RT-PCR半定量技术分别检测0.2mg/ml苦参碱对K562细胞原癌基因c-myc、c-jun、H-ras、p21和肝细胞核转录因子HNF-1α表达的影响。结果:经苦参碱处理3h后K562细胞c-myc、c-jun、HNF-1αmRNA表达明显降低,而H-ras、p21mRNA表达明显增高。结论:0.2mg/ml苦参碱引起的K562细胞相关癌基因表达变化可能与K562细胞的增殖抑制和诱导分化有关。

苦参碱诱导K562细胞分化的差异表达基因的研究

目的研究苦参碱诱导人红白血病K562细胞分化的分子机制。方法应用改良的mRNA差异显示逆转技术(DDRT-PCR)筛选苦参碱诱导K562细胞分化相关的差异表达基因;对差异cDNA片段纯化、克隆、测序及Blast分析,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法验证。进一步对其中的未知差异cDNA片段采用North-ern杂交确定其转录本的大小及组织分布特性,进而充分利用多种生物信息学资源对差异片段进行结构和功能的预测。结果苦参碱诱导K562细胞前后存在明显的基因表达差异,筛选获得了17条差异条带。其中4个差异显著片段经RT-PCR验证后,在Genbank中分析,有3个为已知基因,1个可能为未知基因,暂命名为KH基因。Northern杂交证实KH基因转录本的大小为1.35kb,分布于正常人体脑组织中。结论苦参碱具有诱导K562细胞基因表达谱发生变化的作用,由苦参碱诱导的K562细胞分化是一个多基因参与的过程;KH基因可能是苦参碱作用K562细胞后表达量发生改变的未知基因,可能与细胞癌变有关。

KH基因的细胞、组织mRNA表达谱研究

目的 研究 KH基因的细胞、组织 m RNA表达谱。方法 采用 8种细胞与 Wistar大鼠的 3种组织的RT- PCR与 12种正常人体组织的 Northern印迹杂交分析 ,了解该新基因在不同组织、细胞中的表达。结果 RT-PCR结果显示该基因可在人白血病 K5 6 2细胞和人脐带血有核细胞中表达 ;Northern印迹杂交结果表明该基因在正常人体脑组织中有表达。结论

苦参碱对K562细胞增殖抑制与诱导分化的实验研究

目的 :观察苦参碱对 K562细胞的增殖抑制和诱导分化作用。方法 :以 K562细胞为实验对象 ,采用体外培养技术 ,通过细胞生长曲线、细胞形态、乳酸脱氢酶 (L DH)活性测定方法观察苦参碱的作用。结果 :浓度为 0 .2～ 0 .3mg/ ml的苦参碱对 K562细胞有明显的增殖抑制与诱导分化作用 ,实验组细胞的数量、形态和生化代谢都发生了变化。结论

未知基因KH与公共生物信息资源的比较与分析

目的 快速分析K5 62细胞中未知基因KH的结构与功能。方法 以mRNA差异显示技术筛选的K5 62细胞在 0 2mg/ml苦参碱诱导前、后 3小时的差异基因为研究对象 ,采用基因片段的碱基序列与Internet网上多种公共生物信息数据库进行比较 ,分析未知基因KH的结构与功能。结果 对其中的 4个片段进行序列分析和同源性比较 ,有 3个基因片段与已知蛋白或蛋白酶的碱基序列完全或高度同源 ;有 1个基因片段除与 16号染色体高度同源外 ,与其它数据库均无显著同源性 ,暂命名KH基因。结论 KH基因可能是苦参碱作用K5 62细胞后表达量发生改变的候选新基因。

医学检验专业开设《临床实验室管理学》课程的实践和体会

临床实验室管理学是检验医学与管理学的交叉学科,是随着检验医学的发展而发展起来的新兴学科。在几年教学过程中,深深地体会到临床实验室管理学的重要性和必要性。笔者对教材使用、教学内容安排、教学方法选择、教学时间安排和任课教师选择等方面作了探索。把教学内容和临床实践相结合,运用多种教学方法,激发学生的学习热情,在教学中积累了初步经验。

未知基因KH开放阅读框架真核表达载体的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的 :构建未知基因KH的开放阅读框架 (openreadingframe,ORF)的真核表达体系 ,初步探讨未知基因KH的功能。方法 :采用DNA重组技术将KH基因片段的开放阅读框架 (KH -ORF)亚克隆于表达载体 pCl-neoMammalianExpres sionVector,重组为pCI-neo -KH -ORF真核表达体系 ,脂质体转染K5 6 2细胞 ,RT -PCR检测目的基因KH的表达。采用体外培养技术 ,通过 pCI -neo -KH -ORF质粒转染K5 6 2细胞前后的生长曲线和乳酸脱氢酶活性测定观察KH -ORF对K5 6 2细胞增殖速度的影响。结果 :KH -ORF在K5 6 2细胞中获得表达 ,对细胞增殖速度有明显影响。结论 :KH -ORF表达产物可能是一个与K5 6 2细胞增殖有关的功能蛋白质 。

K562细胞未知基因KH的开放阅读框架在大肠杆菌中的表达

目的 :构建K5 6 2细胞未知基因KH的开放阅读框架 (openreadingflame ,ORF)的原核表达体系。 方法 :采用DNA重组技术构建KH基因片段的开放阅读框架 (KH -ORF)的表达载体pCI-neo-KH -ORF ,热休克法转化大肠杆菌BL2 1(DE3)plysS ,IPTG诱导后 ,SDS -PAGE鉴定目的蛋白的表达。结果 :经IPTG诱导 0 .5h后KH -ORF在BL2 1(DE3)plysS中获得表达 ,表达产物以包涵体形式存在 ,分子产量约 2 4kD。结论 :成功构建了KH -ORF的原核表达体系 ,为进一步研究其功能奠定了基础。

苦参碱对TIM2转基因小鼠肝癌细胞的作用研究

目的:观察苦参碱对TIM2转基因修饰小鼠H22肝癌细胞瘤苗的体内作用。方法:构建小鼠TIM2基因真核表达载体并用以转染H22细胞,经体外稳定筛选后获得TIM2转基因H22肝癌细胞全细胞瘤苗(H22-TIM2),用以建立小鼠肝癌移植瘤模型,观察该瘤苗在小鼠体内的成瘤性和免疫原性;加用药物苦参碱(matrine,M)治疗后,观察苦参碱对其体内抗癌活性的影响。结果:筛选得到的TIM2转基因H22肝癌细胞瘤苗有TIM2 mR-NA及EGFP的稳定表达,此瘤苗接种后,在小鼠体内的成瘤率为41%,远低于H22对照组和H22-EGFP空载体组(H22-EGFP)(后两者成瘤率在92%以上),对小鼠肿瘤的抑制率为69.2%,明显高于苦参碱治疗组(67.5%)和其他各组。同时苦参碱可进一步增强H22-TIM2瘤苗的肿瘤抑制率。H22-TIM2组小鼠的脾指数,CD4+T细胞亚群和CD4/CD8较其他实验组明显增高。结论:TIM2基因修饰H22细胞瘤苗可显著降低H22肝癌细胞在小鼠体内的致瘤性,在体内具有一定的免疫原性,苦参碱可明显改善其体内抗癌活性,为进一步研究TIM2基因在肿瘤免疫中的作用及苦参碱的抗癌机制奠定了基础。

苦参碱对K562细胞蛋白酪氨酸激酶及磷酸酶活性的影响

背景与目的:一定浓度的苦参碱能诱导K562细胞分化,本研究拟初步探讨其诱导分化的信号转导机制。方法:运用链亲和素-生物素放大系统结合的酶联免疫法,动态检测苦参碱作用于K562细胞后,K562细胞膜相及胞浆内的蛋白酪氨酸激酶和磷酸酶活性的变化。结果:苦参碱能抑制K562细胞内的蛋白酪氨酸激酶活性,在<0.1mg/ml的浓度范围内,抑制作用具有浓度依赖性。不同浓度的苦参碱对蛋白酪氨酸磷酸酶活性的影响无显著性差异。0.1mg/ml的苦参碱作用K562细胞后,伴随蛋白酪氨酸激酶的活性变化,蛋白酪氨酸磷酸酶的活性也有一个短暂的下降。结论:在苦参碱诱导K562细胞分化的过程中,涉及到蛋白酪氨酸激酶的活性改变。膜相中蛋白酪氨酸激酶的活性改变先于胞浆内的改变,提示有一个信号的跨膜转运过程。同时伴有蛋白酪氨酸磷酸酶的活性变化,反映了胞内的蛋白酪氨酸残基磷酸化与去磷酸化的即时调节机制。苦参碱对蛋白酪氨酸激酶活性的抑制作用具有特异性与饱和性的特点,还提示有相应的受体存在。

苦参碱对小鼠H22肝癌细胞凋亡作用的实验研究

目的:研究中药苦参碱在体内外对小鼠H22肝癌细胞的诱导凋亡作用,探讨其可能的抗肿瘤作用机制。方法:An-nexinⅤ-FITC/PI双标记法检测苦参碱对H22细胞的早期促凋亡作用;免疫组织化学法检测苦参碱作用后H22细胞内Bc l-2、Bax两种凋亡相关蛋白的表达。建立H22肝癌移植瘤小鼠模型,观察苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤生长情况的影响及肿瘤抑制率;电镜观察荷瘤小鼠肿瘤组织的超微结构改变;免疫组化方法检测小鼠肿瘤组织内Bc l-2、Bax的表达情况。结果:AnnexinⅤ法检测到1.0 mg/mL和1.5 mg/mL苦参碱作用48 h后H22细胞有早期凋亡改变,凋亡细胞百分率分别为11.71%和17.86%,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤的抑制率达60%以上;免疫组化显示,苦参碱作用后H22细胞内及小鼠肿瘤组织内Bc l-2蛋白的表达水平下降,Bax蛋白表达增强。电镜证实苦参碱治疗后荷瘤小鼠肿瘤组织内有凋亡细胞和凋亡小体的存在。结论:苦参碱在体内体外都对小鼠H22肝癌细胞表现出较强的抗肿瘤作用和诱导凋亡作用,促凋亡作用与其上调细胞内Bax表达,抑制Bc l-2表达有关。

川楝素通过线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡

目的探讨川楝素对人肝癌细胞SMMC-7721(P53+)、Hep3B(P53-)凋亡及其对相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas表达的影响。方法 MTT法检测川楝素(0.1～0.9μmol/L)对人肝癌细胞增殖的影响;倒置显微镜观察人肝癌细胞形态学改变;Annexin V法检测早期凋亡率;比色法检测Caspase-3、8、9相对活性改变;免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Fas的表达。结果川楝素显著抑制人肝癌细胞增殖,呈时间-剂量依赖性;形态学观察可见细胞数量减少,黏附力降低,皱缩变圆;0.5μmol/L川楝素作用SMMC-7721、Hep3B细胞72h的凋亡率分别为21.55%、18.35%,经Caspase抑制剂z-VAD-fmk处理后,细胞凋亡率降低;川楝素组SMMC-7721细胞Caspase-3、8、9活性均增高,Hep3B细胞Caspase-3、9活性增高,Caspase-8活性无明显变化;免疫细胞化学法显示,川楝素组SMMC-7721细胞Bcl-2表达减弱,Bax和Fas表达较CTX阳性对照组增强,Hep3B细胞Bcl-2表达减弱,Bax表达增强,Fas表达无明显变化。结论川楝素对P53+和P53-的人肝癌细胞均有抑制增殖、诱导凋亡的作用,涉及线粒体途径的参与,可能是一种通过非P53依赖途径发挥抗癌作用的天然药物。

苦参碱抗肿瘤作用及其机制的初步研究

目的:研究中药苦参碱(Matrine)的抗肿瘤作用及其免疫学机制。方法:MTT比色法检测肿瘤细胞的生长抑制率;流式细胞术分析细胞周期的改变。建立荷瘤小鼠模型,观察小鼠肿瘤的生长情况,计算肿瘤生长抑制率;MTT法测定苦参碱对荷瘤小鼠PBMC体外增殖作用的影响;ELISA法检测苦参碱治疗后小鼠血清中IL-2和IL-12的活性。结果:苦参碱可显著抑制小鼠肿瘤细胞的体外分裂和增殖,且抑制作用呈浓度和时间依赖性,使G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,细胞增殖指数降低。苦参碱对小鼠实体瘤生长具有显著抑制作用,抑瘤率高达60.7%以上;明显抑制小鼠静止PBMC的体外增殖作用;不能提高荷瘤小鼠血清中IL-2和IL-12的含量。结论:苦参碱具有较强的抗肿瘤作用,体内体外却表现出一定的免疫抑制作用,提高机体的免疫功能不是苦参碱发挥抗癌活性的主要机制。

苦参碱对H_(22)荷瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫功能的影响

目的 研究苦参碱的体内抑瘤效应与荷瘤机体免疫功能的关系 ,初步探讨苦参碱抑瘤作用的免疫学机制。方法 采用 MTT法观察不同剂量苦参碱对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞 (PBL )增殖能力的影响 ;采用小鼠 H2 2 肝癌细胞实体瘤模型进行苦参碱的体内抑瘤实验 ,测定肿瘤生长抑制率 (IR) ,观察荷瘤小鼠免疫器官质量和病理学形态的改变 ;EL ISA法检测小鼠血清中白细胞介素 - 2 (IL - 2 )和白细胞介素 - 12 (IL - 12 )水平。结果 高、低剂量苦参碱对小鼠 H2 2 实体瘤生长具有明显抑制作用 ,抑瘤率分别为 6 0 .7%和 6 2 .5 % (P<0 .0 1) ;体外增殖试验显示 ,苦参碱单独作用时 ,对荷瘤小鼠静止 PBL体外增殖的抑制作用较明显 ,但对刀豆蛋白 A (Con A)活化的荷瘤小鼠PBL 的体外增殖反应表现出一定的促进作用 ,随苦参碱质量浓度的增高 ,促进作用随之减弱 ;苦参碱治疗后小鼠的脾脏和胸腺质量减轻 ,其中以脾脏变化更为明显 (P<0 .0 1) ,病理切片显示胸腺皮质变薄 ;苦参碱不能提高荷瘤小鼠血清 IL - 2和 IL - 12水平 (P>0 .0 5 )。结论 苦参碱在体内具有较强的抗肿瘤作用 ,但在体内、体外都表现出一定的免疫抑制作用 ,显示苦参碱的抗肿瘤活性不是通过提高机体的免疫功能来实现的。

苦参碱对K562细胞骨架的作用观察

目的：从细胞骨架方面进一步探索苦参碱对人白血病K562细胞株的作用机制。方法：采用微管吮吸技术和基因芯片技术分析苦参碱处理前后K562细胞粘弹系数和细胞骨架蛋白基因表达的改变。结果：0.1mg/ml苦参碱作用K562细胞24h后粘弹系数下降，细胞骨架类基因prefoldin 与ezrin 的mRNA表达增强。结论：苦参碱能够导致K562细胞的细胞骨架发生变化。

苦参碱对小鼠H_(22)细胞抗肿瘤作用的实验研究

目的:观察苦参碱在体内和体外的抗肿瘤作用。方法:MTT法检测苦参碱对小鼠腹水瘤细胞H2 2 的体外杀伤作用;AnnexinV -FITC/PI双标记法检测苦参碱对体外培养的H2 2 细胞的诱导凋亡作用;在BALB/C小鼠H2 2 移植瘤模型上观察苦参碱的体内抑瘤活性,透射电镜观察苦参碱治疗后荷瘤小鼠肝癌细胞的超微结构改变;免疫组化法检测荷瘤小鼠肝癌组织中Bcl- 2、Bax蛋白表达。结果:苦参碱在体外能够明显抑制H2 2 细胞的生长和增殖,并可诱导细胞凋亡;对小鼠肿瘤生长也有明显抑制作用,高、低浓度组抑瘤率分别为6 0 .71%和6 2 .5 3% ;用药组小鼠肿瘤组织中,电镜下可见较为典型的细胞凋亡的形态学改变;肿瘤组织中Bcl- 2蛋白表达明显降低,Bax蛋白表达增强,与荷瘤对照组相比有显著性差异(P <0 .0 1)。结论:苦参碱在体内外对H2 2 肿瘤细胞生长均有抑制作用,同时可促进肿瘤细胞表达Bax蛋白,抑制Bcl- 2表达,诱导肿瘤细胞凋亡。

555例慢性化脓性中耳炎的病原学及药物敏感性分析

目的了解慢性化脓性中耳炎耳分泌物病原微生物类型及致病菌的药物敏感性,指导临床合理用药。方法收集2013年1月至2015年3月慢性化脓性中耳炎住院患者(纳入患者555例,共计571耳,其中男性272耳,女性299耳)耳分泌物,经细菌培养和药敏试验,进行病原微生物分离率的排序,检测致病菌的药物敏感度。结果 571耳中培养有微生物生长379耳(占66.37%),其中细菌334耳(占88.13%)、真菌47耳(占12.40%)。细菌检出率依次为凝固酶阴性葡萄球菌191耳(占57.19%)、金黄色葡萄球菌58耳(占17.37%)、铜绿假单胞菌31耳(占9.28%)。药物敏感性因菌种而异。结论慢性化脓性中耳炎活动期患者耳分泌物以凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌为主。药敏试验对临床用药有指导作用。

苦参碱触发的K562细胞胞内钙信号的动态变化

目的 研究苦参碱诱导K5 6 2细胞分化的信号转导机制。方法 以Fura 2 AM为荧光探针 ,定量分析苦参碱作用后K5 6 2细胞内钙离子浓度的动态变化。结果 经苦参碱处理后 ,在胞外有钙的情况下 ,K5 6 2细胞内钙离子浓度由 12 9.0 2nmol/L升至 2 0 7.5 0nmol/L ,并维持较长时间 ;在无胞外钙的情况下 ,胞内钙离子浓度由 12 9.0 2nmol/L迅速升至 16 4 .2 2nmol/L ,并迅速恢复。两者的增高幅度均与苦参碱浓度呈正相关。结论 在苦参碱诱导K5 6 2细胞分化过程中 。

血栓弹力图在重度血小板减少者中的应用

目的研究重度血小板减少患者血栓弹力图指标与出血的关系。方法根据临床诊断将108例血小板小于20×109/L的患者分为出血组和不出血组,并对他们的血小板计数及血栓弹力图检测结果差异进行统计学分析。结果重度血小板减少时,两组患者的性别、年龄、血小板减少类型、凝血象(凝血酶原时间、活化部分凝血酶原时间、凝血酶时间、纤维蛋白原)及血栓弹力图参数中的反应时间、凝固时间、血凝块聚合速度、凝血综合指数、LY30(反映纤溶活性)差异无统计学意义(P>0.05),但出血组的血小板及血栓弹力图参数中的血栓最大幅度(MA)值明显低于不出血组(P<0.01),采用Logistic回归以及ROC曲线分析得到出血=1.253-0.13血小板-0.042 MA,界值点取-1.478 5时,灵敏度、特异度分别为0.667、0.833,且大于该值的患者有93.3%的可能会出血。结论血栓弹力图指标中的MA值在预测重度血小板减少患者的出血倾向时有重要作用。