特异性TCRαβ基因转染T细胞促进抗肿瘤免疫的研究

目的:研究肝癌特异性TCR基因TCRVα12.2-Vβ7.1转染T细胞后,促进T细胞识别肿瘤抗原,活化抗肿瘤免疫反应的效果。方法:构建重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV,以之感染T细胞并优化最佳感染条件。钙黄绿素染色法检测T细胞对不同肿瘤靶细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。流式细胞术检测T细胞表面FasL表达比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果:成功将TCRVα12.2-Vβ7.1基因片段构建入嵌合型腺病毒载体,获得重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV。感染复数为100时,重组腺病毒有最高转染效率。感染3天后,TCRVα12Vβ7阳性细胞比例超过25%。特异性TCR基因转染有效促进T细胞杀伤AFP阳性肝癌细胞,特异性裂解率显著提高(P<0.001)。特异性TCR基因转染有效促进T细胞诱导靶细胞凋亡(P<0.001)。同时,T细胞表面FasL表达比例上升(P<0.001)。TCR基因转染T细胞作用于AFP抗原阳性靶细胞后IFN-γ分泌显著提高(P<0.001)。结论:重组腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV成功介导肿瘤特异性TCR基因转染T细胞。TCR基因转染可有效促进T细胞识别抗原阳性肿瘤细胞,并发挥抗肿瘤免疫效应。

肿瘤特异性TCRαβ基因转染诱导记忆性T细胞分化及其免疫功能的研究

目的研究特异性TCR基因转染T细胞被肿瘤抗原激活后,记忆性T细胞的分化情况,并明确其表型特征和免疫功能。方法密度梯度离心法分离PBMC,重组TCR腺病毒感染T细胞,流式细胞术检测外源TCR表达效率。AFP表位肽刺激T细胞,流式细胞术检测TCR基因转染T细胞经抗原刺激后,记忆性T细胞标志分子表达。MTT法检测T细胞对不同肿瘤细胞株的杀伤活性。Annexin V-PI双染法检测靶细胞凋亡比例。ELISA法检测T细胞作用于靶细胞后IFN-γ与IL-2分泌水平。结果重组腺病毒载体感染3 d后,外源TCR表达比例接近30%。特异性TCR基因转染可有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化,CD45RO+细胞比例逐渐上升至接近50%。CD45RO+细胞以CD62L–CD44+表型为主。此后CD62L+细胞比例逐渐上升。最终出现分群明显的CD62L+CD44+TCM表型细胞。特异性TCR基因转染能够促进T细胞杀伤AFP+靶细胞,诱导靶细胞凋亡,并促进IFN-γ分泌。抗原预先刺激能够进一步增强TCR基因转染T细胞抗肿瘤免疫效应。结论 TCR基因转染能够有效促进T细胞识别肿瘤抗原后活化。经肿瘤抗原预先刺激的TCR基因转染T细胞将启动记忆性T细胞分化,在再次遭遇表达相同抗原的肿瘤细胞时发挥更为强烈的免疫效应。

甘草水煎剂中miRNA的提取及其对人外周血单个核细胞的影响研究

目的:分离提取甘草水煎剂中的微小核糖核酸(miRNA),并初步探索其对人外周血单个核细胞(PBMC)的影响。方法:将甘草干燥药材按照常规方法制备水煎剂,浓缩干燥后采用通用植物microRNA快速提取试剂盒提取其中的miRNA,所得miRNA经DNaseⅠ处理后进行电泳鉴定;分别利用甘草水提物、甘草酸、甘草次酸和甘草miRNA处理体外培养的健康人PBMC,24 h后,对各组进行细胞计数,并观察细胞形态学的变化;分别利用antiCD3、anti-CD56、anti-HLA-DR单克隆抗体染色,检测PBMC中不同细胞亚群的变化情况。结果:电泳结果表明,从甘草干燥药材的水煎剂中确实能够提取到miRNA,进一步印证了miRNA的稳定性。对体外培养PBMC作用结果表明,与空白对照组比较,经甘草miRNA刺激的PBMC发生了明显的抱团,细胞数量增多,HLA-DR+细胞的比例显著增加。结论:本实验成功地从甘草干燥药材的水煎剂中提取到了甘草miRNA,甘草miRNA对PBMC的生长具有促进作用,并能显著增加HLA-DR+细胞亚群的比例。

加味当归补血方对化疗药物诱导小鼠骨髓抑制的影响

目的:观察加味当归补血方对化疗诱导小鼠骨髓抑制的影响。方法:以阿霉素(盐酸多柔比星)诱导小鼠化疗骨髓抑制模型,以外周血有核细胞数量、骨髓细胞周期变化、红系集落单位发育及外周血清EPO含量评价补血方效果。结果:加味当归补血方应用于化疗小鼠后,通过减少骨髓细胞凋亡,促进骨髓细胞加速向S+G2/M期转化,有效提高了外周血有核细胞及血红蛋白数量,同时可通过促进EPO等细胞因子分泌,提高红系造血祖细胞集落产率。结论:加味当归补血方可有效缓解化疗诱导骨髓抑制,促进红系发育。

吞噬细胞的磷脂酰丝氨酸外翻与其血清依赖的调理作用的关系

目的:探讨外周血中单核吞噬细胞的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)外翻与其血清依赖的调理作用之间的关系,为探索生理微环境对于吞噬细胞功能的影响奠定基础.方法:基于Ficoll-paque密度梯度离心法分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),经过PBS充分洗涤之后利用含有和不含血清的RPMI 1640培养基处理细胞,一定时间之后利用Annexin V染色检测血清处理前后PS外翻的情况;通过比色法检测胞膜丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量,以考察脂质过氧化产物对Annexin V检测结果的影响;通过anti-CD3、anti-CD56、antiHLA-DR等不同的表面分子抗体染色,利用流式分析PBMC中不同细胞群的PS外翻情况;利用表达绿色荧光蛋白的细菌与PBMC共孵育,通过流式细胞术检测细胞的吞噬能力.结果:流式分析表明PBMC经血清处理后PS+细胞比例明显升高,并且这种升高发生在血清短暂的处理之后;血清处理对于细胞膜MDA的含量没有显著影响,排除了脂质过氧化对PS检测的影响;针对PBMC的细胞表型分析表明HLA-DR+单核吞噬细胞是PBMC中对血清处理敏感的主要细胞亚群,其在血清处理后Annexin V+细胞中的比例有显著的增加(P<0.05);细菌吞噬实验表明外翻的PS参与了血清诱导的调理作用.结论:吞噬细胞PS外翻是血清依赖的,并且这种外翻的PS参与了对细菌的调理作用.

一种基于TIL的肿瘤相关抗原特异性T细胞的筛选方法

Wolfl 等[1]的研究建立了一种以 CD137为表面标记，从人 CD8＋T 细胞中快速鉴定和分离抗原特异性 T 细胞的方法。由于 CD137分子表达于活化的 CD4^＋和 CD8^＋T 细胞表面[2]，其表达上调依赖于 T 细胞经抗原刺激后活化，并可在抗原刺激后12 h ~5 d 内持续表达[3]。因此可以CD137为标记，从 T 细胞中检测和分离比例较低的抗原特异性 T 细胞。

杀伤细胞免疫球蛋白样受体基因在肝癌细胞免疫杀伤中的作用

目的探讨杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因在肝癌细胞免疫杀伤中的作用。方法外周血单个核细胞(PBMC)与肝癌细胞Hep G2按不同效靶比共孵育,观察不同效靶比共孵育下PBMC中KIR基因家族的表达、γ干扰素(IFN-γ)分泌、肝癌细胞形态学改变及PBMC对肝癌细胞的杀伤情况。杀伤率比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果与肝癌细胞共孵育12 h后PBMC活化性KIR基因表达开始增加,24 h后下降。抑制性KIR基因共孵育12 h后开始下降。辅助活化基因DAP12一直保持高表达水平。PBMC中IFN-γ的含量随着效靶比的升高而降低,12 h达到高峰。共孵育后不同效靶比组的肝癌细胞均表现为染色质浓缩,细胞核呈半球状或半月形状且边缘化的细胞比例增加,细胞停止旺盛分裂。效靶比1∶1组的相对杀伤率为(8±3)%,10∶1组为(14±4)%,50∶1组为(32±6)%,50∶1组明显高于1∶1组和10∶1组(LSD-t=5.97,4.61;P<0.05)。结论活化性KIR基因在肝癌细胞免疫杀伤中发挥重要作用。

甘草水提物中miRNA对人免疫细胞基因表达的影响

微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类在转录后水平调节基因表达的非编码小分子RNA,其调控基因表达、影响细胞活性的功能已为人们所重视。近年来miRNA的跨界调控成为新的研究方向,为人们更全面地认识和了解miRNA的功能提供了新的视角。植物miRNA由于通常经过了甲基化修饰,因此较为稳定,不易降解。前期研究表明,甘草干燥药材的水煎剂中存在着丰富的小分子RNA,这为了解甘草的作用机制提供了新的思路。在本研究中,利用从甘草水煎剂中提取的小分子RNA以及合成的miRNA模拟物(mimic)作用于分离自健康人的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),然后利用RT-PCR对其模式识别受体(PRR)基因以及部分转录因子、信号分子和细胞因子的基因表达变化进行了分析。结果表明甘草miRNA对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用,能够显著抑制T细胞分化相关基因的表达,以及炎症和凋亡相关基因的表达。这为进一步更全面地了解甘草的作用机制以及中药新药的研制带来了新的思路。

基于知识图谱的安全金融服务助力广发银行构建全局思维的风控体系

8月24日,中国人民银行广州分行发布了广州市金融科技创新监管试点应用公示,广发银行凭借“基于知识图谱的安全金融服务项目”成功入选首批试点机构。广发银行通过知识图谱技术,整合行内外数据并进行深入挖掘,打通公私、存贷关系,建立包含企业、个人、事件的关系图谱,构建全行风险识别、风险传导、风险监控的统一平台,为银行实施积极主动的风险管理、提高风险防控能力、守住不发生系统性金融风险的底线提供支持。