双峰驼肝微粒体的制备及CYP1A酶活性检测

为研究双峰驼细胞色素氧化酶1A(CYP1A)的体外活性,首先采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体,并用BCA法测定其蛋白浓度;然后采用CO还原差示光谱法分别测定CYP总酶含量和细胞色素b5含量;最后通过CYP1A酶对7-乙氧基香豆素的脱羟基作用评价其体外活性。结果表明,所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度为1.652mg/g±0.341mg/g,CYP总酶含量为0.08nmol/mg±0.014nmol/mg,细胞色素b5(Cybts)含量为0.113nmol/mg±0.036nmol/mg,且CYP1A酶具有降解其特异性底物-7-乙氧基香豆素的活性。说明所制备的双峰驼肝微粒体悬液蛋白浓度、CYP总酶和Cytb5含量以及CYP1A酶活性等基本参数均能满足后续的双峰驼CYP1A酶体外活性研究基本要求。

采用特异性探针药物法对双峰驼CYP1A酶体外活性的测定

为探究双峰驼CYP1A酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响,首先采用差速离心法制备双峰驼肝微粒体,并优化其体外孵育体系,然后采用高效液相色谱紫外检测法测定双峰驼肝微粒体孵育体系中CYP1A酶特异性底物非那西丁的代谢产物对乙酰氨基酚的动态含量,并借助Origin Pro8.6软件计算CYP1A酶的动力学参数。结果表明,双峰驼肝微粒体具有良好的酶活性,其蛋白质含量为1.652mg/g±0.341mg/g。经优化后孵育体系的最适宜底物的质量浓度为200μg/mL,最佳肝微粒体的质量浓度为4.95mg/mL,最适宜孵育时间为30min。双峰驼CYP1A酶体外孵育体系的最大反应速度为0.224 6nmol/(min·mg)±0.041 8nmol/(min·mg),米氏常数为5.577 9μmol/L±0.634 2μmol/L,内在代谢清除率为0.080 4(mL·min)/mg±0.023 1(mL·min)/mg。结果表明,本试验通过借助特异性探针药物动力学特征的研究,成功检测了双峰驼CYP1A酶的体外代谢活性。