猪伪狂犬病净化策略与应用

1猪伪狂犬病概述。伪狂犬病(Pseudorabies,PR;Aujeszky’s disease,AD)是由狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种多种动物共患传染病,呈世界性分布。对养猪业的危害最为严重。猪伪狂犬病(PR)引起以下四大临床特征:1)繁殖障碍。

不同猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合体液免疫效果评估

为了比较不同猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗不同免疫程序对体液免疫效果的影响,本试验选择新引进猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性后备母猪的3个猪场,将各场内猪只按体重分为3个阶段:7~20、20~35和35~50 kg,各场分别从中选取20头猪,共180头猪。每场选用1种免疫方案,第1组混合疫苗组,为首次免疫PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),28 d后加强免疫PRRS灭活疫苗(CH-1a株);第2组弱毒疫苗组,为2次均免疫PRRS弱毒疫苗;第3组灭活疫苗组,为2次均免疫PRRS灭活疫苗。疫苗首次免疫后14、28、42和56 d采集猪血清,进行特异性PRRSV ELISA(N蛋白)检测和中和抗体评价;首次免疫后14和28 d采集猪血液,进行PRRSV实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血液内是否存在PRRSV;统计试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数,进行临床数据比较分析。结果显示,35~50 kg体重阶段猪只接种疫苗后ELISA检测抗体水平增高较其他2个阶段更明显。混合疫苗组在免疫56 d时血清ELISA阳性率为100%,且ELISA结果极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01)。尽管各组没有产生特异性抗NADC30-like毒株的中和抗体,但针对PRRSV经典和高致病性毒株的中和抗体保护效价结果显示,混合疫苗组在免疫56 d时中和抗体效价极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01);RT-qPCR检测未发现阳性猪;各组试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,混合疫苗组对体液免疫的促进效果显著优于弱毒疫苗组和灭活疫苗组。该试验为临床正确选择PRRS疫苗免疫方案提供了科学数据。

基于猪流行性腹泻病毒GⅡb亚型重组荧光病毒中和抗体检测方法的建立

2010年以来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)GⅡ型变异毒株的出现,导致全世界范围内猪流行性腹泻(PED)的病死率显著增加。疫苗免疫是PED有效防控的重要策略之一,疫苗诱导的中和抗体水平是免疫效果评价和疫苗质量评估的重要指标。然而,在Vero-CCL81上开展的PEDV经典中和试验中所添加的胰酶会导致试验结果不稳定等问题。本研究拟在构建稳定表达绿色荧光蛋白的重组病毒基础上,建立一种能准确评估样品中和抗体的检测方法。本研究在pUC57载体上克隆插入GⅡb亚型PEDV-GDU株部分ORF1a和ORF1b基因片段与其他结构基因片段,并通过无缝克隆技术将ORF3基因替换为EGFP基因,构建辅助质粒pUC57-PEDV-GDU-dORF3-EGFP,通过RNA定向重组技术拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP。进一步通过间接免疫荧光试验(IFA)、Western blot和病毒生长曲线测定等方法,比较重组荧光病毒和亲本病毒生物学特性。最终利用重组荧光工具病毒筛选在不添加胰酶的条件下仍能支持PEDV有效增殖的细胞系,并建立中和试验方法。结果表明,成功拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP,且在Vero-CCL81细胞上,重组荧光病毒与亲本病毒呈现相似的生物学特性。利用该重组荧光病毒筛选到一株亚克隆Huh7.10细胞可支持PEDV在无外源胰酶添加条件下的有效感染与复制。并利用Huh7.10细胞和重组荧光病毒成功建立了PEDV中和试验方法,相关性试验分析表明,该方法测定结果与ELISA抗体检测结果相关性高于PEDV经典中和试验。以上试验结果表明,本研究成功建立了PEDV-GDU毒株的反向遗传操作平台,为PED新型疫苗候选毒株的快速制备提供了有力的工具。此外,基于重组荧光病毒在Huh7.10细胞上建立的中和试验方法能更准确地测定血清中和抗体水平,为疫苗免疫效果的评估提供了有效的技术支持手段。

湖北省南漳县中小规模猪场非洲猪瘟防控联合体探索实践

非洲猪瘟(ASF)对养猪业构成了严重威胁,是全球范围内养猪业面临的主要问题。为有效防控ASF,以湖北省南漳县ASF防控联合体建设为例,探索中小规模猪场的ASF防控新模式。该模式遵循“政府引导、业主自建、行业监管、专家指导”的防控联合体建设原则,以及加强监测预警、强化防控措施、创建合作机制的防控总体规划,利用地理优势和天然屏障,规划出疫病连片防控区,由政府引导中小规模生猪养殖场户组建ASF防控联合体。由政府出资在县界高速、国道、省道等入口处,建设畜禽车辆一级洗消中心,再由联合体成员共同出资在防控区内建设二级洗消中心。防控联合体内,统一防控策略,统一原料及生猪采购,统一防控管理,统一技术指导。防控联合体建设使南漳县ASF防控水平得到了提升,取得了显著的经济和社会效益。该防控联合体模式具有较好的应用推广前景,为中小规模猪场ASF防控和拓宽ASF无疫小区建设提供了新的工作思路。

猪圆环病毒3型的分离及致病性分析

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)是2016年由美国首次报道引起母猪繁殖障碍的一种新型猪圆环病毒,该病毒的致病性尚不完全清楚。为研究PCV3对断奶仔猪的致病性,本研究用PK-15细胞自临床病料分离到1株PCV3毒株,命名为PCV3/CH/HB/XY/2018,全基因组测序分析表明,该毒株属于PCV3a-IM基因亚型。分别用PCV3阳性病料初始匀浆液和第8代细胞培养物采用滴鼻和肌肉注射2种方式感染28日龄断奶仔猪,每组试验猪5头,并设置空白对照组。通过观察和分析试验猪的临床表现、体温、增重、病毒血症、各组织的病毒载量和病理变化等方面评价仔猪感染试验结果。结果显示:PCV3阳性病料初始匀浆液和细胞培养物在感染断奶仔猪后均会引起仔猪出现体温上升、消瘦、皮炎和生长缓慢等现象;病毒血症时间超过14 d,但21 d消失,病毒的组织分布结果表明,PCV3主要感染扁桃体、淋巴结等免疫器官,在脾、肺和扁桃体等组织中的病毒载量最高;感染猪可出现间质性肺炎、淋巴小结增生和嗜酸性粒细胞增多等病理变化。本研究表明PCV3/CH/HB/XY/2018毒株对断奶仔猪有致病性,为PCV3的致病机制研究奠定了基础。

猪产业链中鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-基因组学分析

旨在探究鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-基因组学特征。采用Illumina NovaSeq 6000平台对91株河南省猪产业链中鼠伤寒沙门菌及沙门菌血清型4,[5],12:i:-分离菌进行全基因组测序,通过生物信息学分析,进行其血清型的预测、多位点序列的分型以及质粒类型、耐药基因和毒力基因分析。结果表明,在河南省猪产业链中沙门菌4,[5],12:i:-的流行率(1.58%,50/3173)已经超过鼠伤寒沙门菌的流行率(1.29%,41/3173);91株沙门菌的序列型分为ST34(71.42%,65/91)和ST19(28.57%,26/91);鼠伤寒沙门菌/ST34菌株和4,[5],12:i:-/ST34菌株都是IncHI2A_1、IncHI2_1和Col440I_1质粒的偏好宿主;沙门菌血清型4,[5],12:i:-携带率较高的耐药基因是blaTEM-1B_1(72%)、tet(B)_2(90%)、sul2_3(66%)、blaOXA-1_1(34%)等;相比鼠伤寒沙门菌菌株,沙门菌血清型4,[5],12:i:-菌株中质粒的携带率更高,且携带更多种类的耐药基因和毒力基因。本研究首次证实,河南省猪产业链中沙门菌血清型4,[5],12:i:-的流行已经超过鼠伤寒沙门菌,在一定程度上解释了该血清型在河南省病人中主要流行的原因。

基于16S rDNA高通量测序技术分析受水灾影响猪场水样的菌群特征

2021年7月,河南省部分地区突发特大水灾,致使受灾区域内的猪场损失惨重,本研究旨在探究水灾发生后猪场水样中存在的病原菌,为猪场防控可能出现的疾病提供技术支撑。通过实地采样和委托采样的方式,获得了26个受灾猪场中的48份水样,包括19份猪饮用水、22份场内积雨水和7份废弃污水,采用菌落计数和高通量测序技术,对样品的细菌总数和菌群丰度进行分析研究,同时对采集的水样开展消毒剂杀菌试验。结果发现:饮用水、积雨水和污水中的平均含菌量分别为1.55×10^(5)、1.88×10^(8)和3.70×10^(9)CFU·mL^(-1),其中污水中的细菌总数最多,其次为积雨水,饮用水中的细菌总数最少,但远超国家饮用水的安全标准。本研究在不同种类的水样中均检测到了链球菌属、埃希氏杆菌属、弓形杆菌属、不动杆菌属和假单胞菌属等潜在的致病菌属,以及嗜低温弓形杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和豚鼠气单胞菌等致病菌。杀菌试验显示,氯制剂终浓度达到2500mg·L^(-1),作用30 min即可杀灭积雨水和污水中所有的细菌。本研究发现,水灾后养猪场内的水样中含有多种致病菌,规模化猪场可选用含氯消毒剂对场内污染的水体进行消杀,以确保人和猪群的健康安全。

副猪格拉瑟菌与猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断和防治

为了诊断某场育肥猪群突发呼吸系统疾病、高死亡率的病因,评估防治方案对该疫病的控制效果。本试验通过现场观察发病猪临床症状、濒死猪器官病变情况,结合实验室检测结果开展综合诊断;根据诊断结果制定了相应的防控方案并评价其效果。结果显示,该场发病猪为副猪格拉瑟菌和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的混合感染。制定的防控方案为:群体给药酒石酸泰万菌素和复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液控制住细菌感染后,迅速接种PRRSV弱毒苗,隔离发病猪,加强环境和流动人员消毒,记录不同栋舍猪群的存栏量和周死淘率直至猪群出栏。实施紧急防控方案后,暴发栋舍周死淘率显著低于采取措施之前(P<0.05),相连栋舍未暴发疾病。结果表明,群体给药酒石酸泰万菌素和复方磺胺间甲氧嘧啶钠,免疫PRRSV弱毒苗,配合控制人员和物资流动、加强猪舍环境管理等防治措施,能够有效的控制副猪格拉瑟菌和PRRSV混合感染。

规模化猪场猪瘟、细小病毒、口蹄疫抗体水平监测和免疫效果分析

应用正向间接血凝试验检测来自6 个省( 市) 的44 个规模化猪场共754 份血清中的猪瘟抗体水平,其中331 份猪瘟血清抗体低于或等于1 8,占44.16% ,低于临界保护线,421 份血清的抗体水平大于或等于116,占55.84% ,可视为免疫合格;母猪、育肥猪和仔猪的免疫合格率分别为66.7% 、37.96% 、22.02 % 。母猪、育肥猪、仔猪血清中猪瘟抗体为零的百分比和份数分别为7 .26 %(32/441)、15.32% (21/137) 、33.03% (36/109) ,免疫效果最差的是仔猪。用正向间接红细胞凝集试验检测310 份血清的口蹄疫抗体效价,其中78.39% 的血清抗体水平低于或等于164 ,仅有21.61% 的血清抗体大于或等于1 128,达到临界保护线。中猪、仔猪、母猪的抗体水平低于1 128 的比例分别为93.75% 、92.59 % 、62.42% 。用血凝抑制试验检测了来自5 个猪场的203 份细小病毒血清抗体。猪场阳性率为100% ,猪只阳性率为79.31% ,其中母猪、仔猪、中猪的抗体阳性率分别为90.65% 、73.33% 、60.78% 。

猪伪狂犬病流行病学特征、净化技术及其应用示范

自20世纪80年代以来,伪狂犬病严重影响全球养猪业,我国也不例外,部分发达国家消灭了家猪的伪狂犬病。近5年来,国家生猪产业技术体系疫病防控功能研究室,参考国际先进经验,结合我国猪伪狂犬病现状和净化目标,制定了"流行病学调查、强化免疫、检测淘汰、清群、监测维持"等5个阶段的净化方案,加强生物安全体系,在综合试验站开展技术应用与示范,取得了明显的效果,同时分析研究了新出现的猪伪狂犬病,提出了初步的解决方案。

猪伪狂犬病基因缺失疫苗的制备、安全性、免疫原性、保存期测定及区域试验

为了提供有效的伪狂犬病疫苗,用鸡胚成纤维细胞扩大培养了PrV HB-98突变株(TK-/gG-/LacZ+),研制了伪狂犬病基因缺失疫苗,并对该疫苗经肌肉接种、经口等免疫途径的最小免疫剂量进行了测定,同时也对4批疫苗的安全性、效力、免疫期和保存期进行了检测;同时将4批疫苗用于免疫23个猪场的母猪、新生仔猪和育肥猪进行区域试验。测定结果表明,疫苗经上述两种途径接种对不同阶段猪的最小免疫剂量均为105.0TCID50;10倍免疫剂量的疫苗对初生仔猪、15日龄仔猪和妊娠母猪是安全的,免疫猪能抵抗强毒的攻击;疫苗在4℃和-20℃下分别可保存6个月和12个月。对伪狂犬病毒抗体阴性的70日龄商品猪和种猪的免疫期为6个月。田间试验表明,4批猪伪狂犬病基因缺失疫苗安全有效,并可用于仔猪发病时的紧急接种。为猪伪狂犬病基因工程疫苗的制备与应用提供了有力的依据。

检测猪细小病毒血清抗体乳胶凝集试验方法的建立及初步应用

将猪细小病毒在IBRS-2细胞上同步培养增殖，待出现细胞病变后，反复冻融，收获病毒液，用甲醛灭活。随后用经硫酸胺沉淀、透析后浓缩的细小病毒液进行方阵滴定，选择致敏乳胶的最佳条件，制成细小病毒乳胶凝集试验（LAT）抗原。抗原与细小病毒阳性血清反应出现肉眼可见的凝集颗粒，而与生理盐水、PBS、犊牛血清、猪瘟、衣原体、口蹄疫、伪狂犬病、弓形体及萎缩性鼻炎等阳性血清不出现凝集现象。用所建立的细小病毒乳胶凝集试验（LAT）与血凝抑制试验检测了203份猪血清，其中血凝抑制抗体阳性为161份，阴性为42份，阳性率为79.31％;乳胶凝集抗体阳性为150份，阴性为53份，阳性率为73.89％，两种方法阳性符合率为93.16％，经统计学检验P＞0.05，两者差异不显著。结果表明，乳胶凝集试验可以作为临床上大量血样进行血凝抑制试验前的初筛，具有简便、准确的优点，在检测细小病毒（PPV）抗体上具有较好的应用前景。

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及药敏试验

对从全国 30多个猪场送检的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪中 ,用PPLO培养基进行了胸膜肺炎放线杆菌的分离 ,对分离菌进行了PCR鉴定和生化鉴定 ,并测定了该菌的培养特性、致病性和对药物的敏感性。结果成功分离到了15株胸膜肺炎放线杆菌 ,该菌对先锋霉素类和氯霉素较敏感。

猪伪狂犬病病毒双基因缺失突变株(HB-98株)安全性、稳定性和免疫原性测定

对以伪狂犬病病毒鄂A株为亲本毒株构建的TK和gG双基因缺失突变株（PrV HB-98株）的增殖能力、安全性、毒力稳定性和免疫原性进行了测定。结果表明，PrV HB-98株在BHK-21细胞上的增殖滴度为10^7.0 TCID50／0．1mL以上，与亲本毒株相当，但高于Bartha株；与PrV鄂A株相比，病毒量为10^7.0TCID50的PrV HB-98株不引起BALB／c小鼠的死亡，毒力也低于Bartha株；将PrV HB-98株在PK-15细胞连续培养25代和在猪体内上连续继代5次，各代次突变株TK基因和LacZ基因能被稳定扩增，未出现毒力回复现象．表明该毒株具有良好的遗传稳定性；以10^5.0、10^6.0、10^7.0TCID50等3个不同剂量的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，母猪均能正常产仔．仔猪也未出现任何临床症状，证明该毒株有较好的安全性。另外，以10^5.0TCID50的PrV HB-98株接种于妊娠50～60d母猪和1日龄仔猪，分别于接种后28d和20d，用10^7.0TCID50 PrV鄂A强毒进行攻击．结果免疫猪都能抵抗强毒的攻击．获得保护，表明该毒株具有很强的免疫原性。综合上述结果表明，PrV HB-98株可以作为候选毒株．用于伪狂犬病基因工程疫苗的研制。

乳胶凝集试验检测猪伪狂犬病血清抗体的研究

用ＢＨＫ－２１细胞增殖猪伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）鄂Ａ株，病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇浓缩后与等量经胰酶处理的乳胶制成凝集试验抗原。此抗原与伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清以及新鲜血清样品均呈现明显的凝集反应；与标准阴性血清和临床未感染ＰＲＶ的猪血清均不发生凝集反应；与猪瘟阳性血清、衣原体病阳性血清均呈阴性反应。证实所建立的乳胶凝集试验具有微量、简便、快速、敏感性高、特异性强的优点，可用于伪狂犬病抗体的定性和定量检测，特别适宜基层现场检疫应用。

猪衣原体病和布鲁氏菌病血清学调查

应用间接血凝法对来自 5个省 (湖北、广东、河南、江西、海南 )的 444份猪血清和用虎红平板凝集法对湖北省 7个猪场的 3 4 0份猪血清分别进行衣原体病和布鲁氏菌病血清学调查。结果 ,衣原体病抗体阳性率平均为 17.0 % ,各猪场的感染率差异较大 ;衣原体病血清抗体阳性猪场达到 67.8% ;检查 2个猪场不同年龄段的猪 ,衣原体病抗体阳性率也不同 ;布鲁氏菌病抗体阳性率平均为 9.7% ,所检的 7个猪场中有 4个猪场为阴性。

乳胶凝集试验检测鸡传染性鼻炎血清抗体的研究

将 A型和 C型鸡副嗜血杆菌培养后 ,菌落计数 ,离心计数 ,离心后用 0 .0 1M p H7.4磷酸盐缓冲液洗涤菌体 2次。经过对致敏温度、致敏时间、致敏乳胶的菌体浓度及菌体的处理方式等条件的选择 ,建立了检测鸡传染性鼻炎血清抗体的乳胶凝集试验。与琼脂扩散试验相比 ,特异性一致 ,但更加敏感 ,且操作简便、快速。结果说明 ,该方法有较好的应用前景 。

规模化猪场常见呼吸道疾病鉴别诊断与防控

猪呼吸道疾病由多种病原引起,但是,猪舍设计、猪饲养密度、通风状况、清洁卫生等可诱发该病并加重损失。控制该病,需要做鉴别诊断,采取针对性措施。一、细菌性呼吸道疾病（一）副猪嗜血杆菌病副猪嗜血杆菌病主要影响保育阶段猪,病原有15个血清型,我们自2002年以来的监测结果表明,我国主要流行血清4型和5型,血清13型在某些地区占优势。