马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备

利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒(PLRV)外壳蛋白(CP)基因(PLRV-CP),回收大小约630bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52～177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10(pBAD-LRCP-126),获得了34kD的诱导表达的融合蛋白(重组CP)。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。