TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响

曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。有研究表明TSA处理可以提高核移植胚胎的发育率。为探讨TSA对猪核移植胚胎发育的作用,试验重点研究了TSA浓度及处理时间对核移植胚胎体外发育的影响,同时也探索了TSA对不同供核细胞构建的重构胚体外发育的影响。结果表明,40nmo·lL-1的TSA处理核移植胚胎可以显著提高其体外囊胚发育率;40nmo·lL-1TSA处理重构胚12和24h,两组重构胚的卵裂率与囊胚发育率差异不显著;40nmo·lL-1TSA处理12h对不同供核细胞构建的重构胚均具有提高囊胚发育率的效果,不同供核细胞所构建的重构胚发育率无显著差异。由此可知,40nmo·lL-1TSA处理12或24h可以提高猪体细胞核移植胚胎体外发育能力。

精浆对猪精子冷冻效果影响的研究

为优化猪精子冷冻技术,提高解冻后精子的活力和受精能力,本试验分别以含精浆浓度为10%、20%和30%的冷冻保护剂处理精子,以冷冻前、解冻后精子活力和质膜完整性,解冻后精子进行体外受精(IVF)的卵裂率和囊胚率等作为检测指标,同时以含有卵黄的Tris-柠檬酸-葡萄糖(Tris-citric acid-glucose,TCG)冷冻基础液作为对照研究精浆对猪冷冻精子的保护作用。结果显示,在含有10%精浆浓度的稀释液中,冷冻前质膜完整性,解冻后精子活率、质膜完整性、IVF囊胚率相对于对照组均显著提高(P<0.05);当含有10%精浆的冷冻精液解冻后用于人工授精时,与配母猪妊娠率、窝产仔数、窝产活仔数等仍显著低于鲜精授精组(P<0.05)。上述结果表明,含10%精浆的冷冻保护剂能提高精子的冷冻后活力和IVF胚胎发育率,但用于人工授精配种与鲜精相比还有一定差距。

猪源Lin28基因的克隆及其在猪胎儿成纤维细胞中的表达

Lin28广泛地表达于早期胚胎中,是重编程的一个重要诱导因子。根据GenBank中公布的猪源Lin28的序列设计合成引物,以猪桑葚胚cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增其编码区全序列。将此克隆片段连接到PMXs表达载体上,构建逆转录病毒载体PMXs-Lin28。在293T细胞中包装携带Lin28基因的逆转录病毒,感染猪如猪胎儿成纤维细胞(Porcine embryonic fibroblasts,PEF)。免疫荧光及Real-time结果显示,PMXs-Lin28载体能够介导Lin28 mRNA和蛋白质在猪胎儿成纤维细胞中的高效表达,Lin28基因能够激活Oct4、Sox2、Nanog、Klf4和c-Myc基因的表达。

猪sall4b基因的克隆及表达分析

sall4基因是sall基因家族的一个成员,在胚胎发育、器官形成和干细胞多能性的维持以及重建中都起到重要作用,有sall4a和sall4b两种剪切突变体类型。目前猪的sall4基因序列尚未获得。鉴于其在多能性细胞调控中的作用,对猪的sall4基因进行了克隆测序,并对其在各组织及胚胎中的表达进行了初步研究。通过5和3 RACE克隆得到猪sall4基因cDNA全长序列(2 372 bp),序列分析证明此基因编码的蛋白结构更接近于小鼠和人Sall4B亚型,同源性可达70%～80%,而与其他物种的Sall4A相比则缺少一段含锌指结构域的片段,同源性降至30%～55%。Real-time PCR证明猪sall4b基因广泛表达于猪的各种器官,其中除卵巢组织呈高量表达之外,脾、肺、心和睾丸表达量也相对较高;在早期胚胎发育过程中除4-细胞阶段相对表达量较低,其他阶段呈高量表达。免疫荧光跟踪Sall4在猪早期胚胎中的表达情况发现Sall4在着床前胚胎中全程表达并定位于细胞核中,在囊胚阶段基因表达趋向于定位在内细胞团中。表达分析证明sall4b基因与多能性紧密相关,预示着猪sall4b基因将可能作为新的重编程因子用于诱导猪多能干细胞的体系中。

慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转基因标记法研究猪嵌合体制作

目的:通过建立慢病毒载体感染猪胚胎体系实现胚胎标记,进而研究不同发育阶段猪孤雌胚胎之间的嵌合能力,为进一步研究猪早期胚胎发育以及细胞分化奠定基础。方法:首先,通过显微注射的方法把2×109I.U./ml、2×108I.U./ml和2×107I.U./ml三个梯度的表达绿色荧光的慢病毒载体分别注射到猪1-细胞胚胎和2-细胞胚胎的透明带下,进行胚胎的GFP转基因标记,在荧光显微镜下观察比较卵裂率、阳性胚胎率、囊胚率、阳性囊胚率和囊胚细胞数。然后,采用凹窝聚合法对同步发育胚胎在不同阶段(2-细胞,4-细胞,8-细胞)进行嵌合,2-细胞胚胎与不同发育阶段(2-细胞、4-细胞、8-细胞)胚胎进行嵌合以及2-细胞胚胎卵裂球互换制作嵌合体胚胎,发育到囊胚时在荧光显微镜下检测胚胎的嵌合状态。结果:2×109I.U./ml的慢病毒感染猪2-细胞胚胎组中,体外受精和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著高于其它滴度组(P<0.05),另外,慢病毒感染的两种胚胎与对照组对卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数三个指标没有显著影响(P>0.05)。2-细胞胚胎之间嵌合囊胚率和2-细胞卵裂球互换嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)显著高于2-细胞胚胎与4-细胞胚胎的嵌合率(18.60%,P<0.05),在同步发育胚胎中8-细胞胚胎之间的嵌合率(75.00%)高于4-细胞胚胎之间和2-细胞胚胎之间的嵌合率(65.00%、53.80%)。结论:2×109I.U./ml的慢病毒感染2-细胞期胚胎效率最高,另外,慢病毒感染对猪胚胎发育没有明显影响。8-细胞间的嵌合率比较高;发育同步胚胎间的嵌合率高于发育非同步胚胎间的嵌合率。

甲基-β-环化糊精对猪体外受精及早期胚胎发育的影响

为了优化猪体外受精技术体系,本试验探索了甲基-β-环化糊精(methyl-beta-cyclic dextrin,MBCD)对猪体外受精以及早期胚胎发育的影响。在体外受精0和4 h向受精液(modified Tris-buffered medium,mTBM)中添加不同浓度(0,0.5,1,2,5,10,15,20μmol/mL)的MBCD,受精孵育结束后转至PZM-3培养液中进行胚胎培养。对各处理组卵母细胞的受精情况以及胚胎发育能力进行了系统的检测,并用金霉素(chlortetracycline,CTC)染色法评估了MBCD处理后精子获能状态。结果显示:1)体外受精0 h添加5μmol/mL MBCD组的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著高于(P<0.05)对照组和除10μmol/mL MBCD组之外的其他试验组。2)体外受精0 h添加5和10μmol/mL MBCD组、单精入卵率显著高于(P<0.05)对照组和其他试验组,而多精入卵率显著低于(P<0.05)对照组和其他试验组。3)添加5μmol/mL MBCD组,0～1 h,F型精子迅速减少(78.56～19.43),B型精子迅速增加(10.79～69.86);1～4 h,F型精子和B型精子基本保持不变(B型:69.86～78.78,F型:19.43～9.11)。上述结果表明在体外受精0 h向mTBM中加入5μmol/mL MBCD可以显著提高获能精子比例,减少多精受精发生,提高早期胚胎发育潜能。

小鼠孤雄单倍体胚胎干细胞增殖的研究

孤雄单倍体胚胎干细胞(androgenetic haploid embryonic stem cells,AG-ha ESCs)是来源于只具有一套精子染色体组的单倍体胚胎。小鼠AG-ha ESCs在培养中呈现克隆较小、生长缓慢的现象。该研究比较了小鼠AG-ha ESCs与正常二倍体胚胎干细胞(R1细胞)、二倍化后的AGha ESCs(DAG-ha ESCs)的生物学特征并探索其中的机制。结果表明,尽管小鼠AG-ha ESCs与R1细胞一样成集落样生长、边缘光滑清晰,但细胞大小与增殖速率均显著小于R1细胞;DAG-ha ESCs的增殖速率略高于AG-ha ESCs,但仍然显著低于R1。更为重要的是,通过RT-q PCR检测分析表明,AGha ESCs和DAG-ha ESCs细胞周期调控网络有异常,因此,单倍体基因组转录调控的异常是小鼠AGha ESCs增殖缓慢的关键因素,而不是克隆大小和二倍化。该研究为今后AG-ha ESCs细胞周期调控方面的进一步研究提供了良好的平台。

顶体反应进程对公猪精液体外受精最佳精卵比的影响

精液质量参数相似公猪获得相同体外受精(in vitro fertilization,IVF)效果时所需精卵比不同的原因。常规方法鉴定公猪精液质量参数,以不同精卵比进行体外受精并确定不同公猪精液体外受精时的最佳精卵比,分别检测了各公猪精子结合透明带能力、获能及顶体反应状况。3头试验用公猪(A、B和C)精液在精子密度、活率、活力和畸形精子率上无显著差异(P>0.05),17℃保存3 d内精子的活率在三者间无差异(P>0.05)。3头公猪精液在IVF中达到最佳受精效率时所需的精卵比分别为500∶1、1 000∶1和200∶1。精子结合透明带能力和获能进程检测显示三者无显著差异(P>0.05),但顶体反应进程检测显示三者间具有显著差异(P<0.05)。顶体反应进程差异是导致相似精液质量精液之间在IVF中最佳精卵比不同的主要原因。

Xist敲降可以改善孤雄单倍体囊胚质量

单倍体胚胎干细胞研究一直以来吸引着研究者们的注意,它可以用作基因修饰的工具或是用于药物筛选。随着孤雄胚胎干细胞系的成功建立,更扩展了单倍体胚胎干细胞的应用前景。但单倍体孤雄胚胎发育率低,胚胎质量差,制约着孤雄单倍体胚胎干细胞的建系。为改善孤雄单倍体胚胎发育潜能及胚胎干细胞建系效率低的问题,我们检测了小鼠(Mus musculus domesticus)孤雄单倍体胚胎的体外发育过程和该过程中Xist基因表达情况。结果发现,孤雄单倍体胚胎囊胚发育率只有10%~14%,发育至囊胚所需时间差异较大,从3.5~5.5 d不等。通过核糖核酸荧光原位杂交实验(RNA-FISH)跟踪Xist基因表达情况,发现其在发育至囊胚阶段的胚胎中呈抑制状态,而在早期胚胎中多呈表达状态。通过si RNA扰低Xist表达,虽然没有改变孤雄单倍体胚胎发育到囊胚的比例,但显著提高了囊胚质量,并提高了接种胚胎内细胞团(ICM)后建立细胞系的效率。结果说明,Xist基因的表达可能是导致小鼠孤雄单倍体胚胎质量差、干细胞建系率低的原因之一。