治疗型双质粒HBV DNA疫苗的构建及其鉴定

为构建以人白细胞介素 2 /γ干扰素(hIL 2 /hIFN γ)融合基因为佐剂的治疗型HBVDNA疫苗 ,采用DNA重组技术分别构建含有HBV包膜中蛋白 (preS2 ·S)抗原和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白的真核表达质粒即pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF ,酶谱和测序分析表明克隆的preS2 ·S和hIL 2 /hIFN γ融合蛋白基因片段的方向、序列与预期相符。用脂质体转染试剂转染COS 7细胞 ,并用ELISA检测转染细胞培养上清中目的基因表达水平。结果显示 ,质粒转染后 4 8h达峰值 ,分别为HBsAg(P/N) =7.6 3、IL 2 =1 0 .35ng/ml、IFN γ =7.90ng/ml。以CTLL 2依赖细胞株/MTT比色法和微量细胞病变抑制法 (WISH VSV)检测pcDNAIIF转染后 4 8h培养上清中IL 2及IFN γ活性 ,结果分别为 998U/ml和 2 4 9U/ml。证明构建的重组质粒pcDNAS2 ·S和pcDNAIIF结构正确 。

治疗型HBV基因疫苗免疫效果的研究

为探索治疗型HBV基因疫苗治疗慢性乙型肝炎的可行性 ,自行构建了HBV包膜蛋白前S2 ·S基因及人IL 2和IFN γ融合蛋白基因真核表达质粒 ,并将双质粒融合蛋白作为佐剂组合成治疗型HBV基因疫苗 ,在健康小鼠、HBV转基因 (Tg)小鼠、新西兰兔和恒河猴体内进行了免疫效果试验。结果发现 :①特异性CTL活性提高 ;②对HBsAg特异性T细胞增殖能力提高 ,HBsAg 3 0 μg /ml对pcS2 ·S免疫的小鼠脾细胞的刺激指数 (SI =5 6± 0 9)明显较空白质粒pcDNA3 1组 (SI =2 0± 0 5 )为高 (P <0 0 1) ,免疫组的IL 2 /IFN γ分泌水平为 (2 2 6 3± 41 0 5pg/ml) /(5 1 1± 7 7pg/ml) ,明显较空白组的 (69 0± 2 2 1pg/ml) /(0 9± 0 7pg/ml)为高 (P <0 0 1) ;③HBV基因疫苗免疫健康小鼠局部引流淋巴结中DCs的诱导HBsAg致敏T细胞增殖指数 (4 2 0 )较pcDNA3 1组 (2 5 5 )为高 ;⑤用在体电脉冲法注射治疗型HBV基因疫苗后 ,检测血清抗 HBs水平 ,无论是小鼠、兔还是猴均有明显提高。提示该治疗型HBV基因疫苗能较好地诱导体液和细胞免疫 。

治疗型HBV DNA疫苗在小鼠组织中的分布和长期毒性研究

为研究治疗型HBVDNA疫苗使用的安全性 ,观察质粒在小鼠组织中的分布和其长期毒性 ,采取给小鼠肌注 电转染治疗型HBVDNA疫苗 1 0 μg和 5 0 μg后 ,用PCR法检测外源基因在小鼠组织的分布和存留时间 ;另用小鼠肌注 电转染治疗型HBVDNA疫苗30、6 0和 1 2 0 μg,每周 2次 ,连续 4周 ,共 8次 ,于末次给药后 4 8h,各组活杀 1 / 2 ,留下 1 / 2继续观察 4周 ,进行血液学、血生化、病理组织学及抗核抗体检查。结果单次肌注 电转染疫苗后 ,质粒DNA主要分布于注射部位肌肉组织 ,可存留 8周 ,其他组织也有散在低水平分布 ,但持续时间较短 ;未发现动物有异常表现 ,血液学、血生化和病理组织学检查未见异常 ;未观察到抗核抗体的产生和自身免疫病理损害。上述结果表明 。

电脉冲肌注法增强治疗型HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究

为提高细胞内质粒DNA的导入率并增强DNA疫苗诱导的免疫效果 ,采用在体电脉冲肌注法接种治疗型HBVDNA疫苗。结果接受电脉冲(2 0 0V/cm)肌注的 8只BALB/c小鼠局部肌肉组织荧光素酶活性为 1 6 1 70± 1 2 5 33RLU ,未加电脉冲对照组为 8 0 2±8 0 0RLU ,相差 4个数量级 ,差异具非常显著性 (P <0 0 0 5 ,t=3 6 74 )。新西兰兔电脉冲肌注法接种后第 2、4周 ,双质粒 (pS2 ·S +pFP)大剂量组 (5 0 +5 0 μg/只 )血清抗 HBs阳性动物数明显较同期未加电脉冲对照组 (大剂量 :1 0 0 0 +1 0 0 0 μg/只 )高 ,差异具显著性意义 (P <0 0 5 ) ;第 1 3周时 ,电脉冲免疫大 (5 0 +5 0 μg/只 )、中 (2 5 +2 5 μg/只 )、小 (5 +5 μg/只 )剂量组均有血清抗 HBs阳性鼠出现 ,分别为 5、4和 4 只 ,组间阳性动物数并无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,但均较同期的对照组高 ,并具有显著性意义 (P <0 0 5 )。恒河猴电脉冲肌注法接种后 8周血清抗 HBs阳性动物数为大剂量 (1 0 0 0 +1 0 0 0 μg/只)组 3/ 3只 ,中剂量 (5 0 0 +5 0 0 μg/只 )组 2 / 3只 ,小剂量 (1 0 0 +1 0 0 μg/只 )组 0 / 3只 ,大剂量组与小剂量组及非电脉冲对照组之间比较差异具有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;至免疫第 1 3周时 ,电脉冲免疫的大、中、小

治疗性双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺研究

目的研究双质粒HBV DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法首先通过计算质粒拷贝数，检测工程菌DH5α/pS2．S和DH5α/pFP在传代过程中的遗传稳定性，通过摇瓶培养确定培养基组成，再在30L发酵罐内，通过改变培养基成分、培养时间、补料方式，确定最佳发酵参数。并将确定的最佳发酵参数应用于50L发酵罐连续3批中试规模的发酵，同时考察在发酵培养过程中质粒稳定性和超螺旋质粒DNA的比例。结果工程菌DH5α/pS2．S和DH5α/pFP在连续传代30次后，质粒拷贝数保持稳定。确定最佳发酵参数为以甘油为碳源的培养基培养，梯度恒速流加方式补料，培养时间为10h。通过3批稳定发酵，最终可获得湿菌58．0～71．8g／L，质粒含量可达到1．11～1．58mg／g菌，超螺旋质粒DNA的比例达93％以上。结论已建立了稳定的双质粒HBV DNA疫苗工程菌中试发酵工艺，为进一步规模化生产奠定了基础。

治疗型HBV DNA疫苗肌注电转染法免疫恒河猴的效果及安全性观察

为观察肌注 电转染法接种治疗型HBVDNA疫苗对恒河猴的免疫效果 ,对健康恒河猴采用肌注 电转染法接种治疗型HBVDNA疫苗 ,剂量分别为 0 2mg/只、1mg/只和 2mg/只 ;前 3次给药时间间隔 1个月 ,主要观察免疫效果 ;此后 6次给药为每天 1次 ,观察重复给药的安全性。结果显示肌注 电转染法接种疫苗后 ,不同剂量组均可有效诱导恒河猴产生HBsAg特异性抗体 (抗 HBs) ;重复给药未见明显的各系统毒副反应及血液学和血生化异常 ,血清抗核抗体 (ANA)阴性。表明治疗型HBVDNA疫苗用肌注 电转染法免疫可显著增强恒河猴的免疫效果 ;多次重复接种该疫苗未见恒河猴的毒性反应 。

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的:探讨治疗性双质粒HBVDNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法:以脂质体转染试剂LipofectamineTM2000介导,将带有preS2+S基因的重组疫苗质粒pS2.S和带有hIL2+hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞,同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组,于转染后24,48,72,96h采用ELISA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素(IL-2)及干扰素(IFN-γ)的表达,并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性,采用ECLWesternblotting分析和鉴定目的蛋白preS2+S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果:双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达,且48h时目的蛋白的表达量达峰值,其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性,pS2.S和pFP的转染上清分别在30.6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论:HBVDNA疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h,并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30.6ku和110ku。

细胞介素融合蛋白质粒促进乙肝病毒DNA疫苗诱导的抗体产生

目的:初步评价人白细胞介素融合蛋白质粒(pFP)以不同方式和剂量,联合乙肝DNA疫苗(pS_2.S)1次性接种诱导健康小鼠体液免疫应答的效果,并探讨其作用机制。方法:第1批分为pS_2.S(10μg.只^(-1))与pFP(10μg.只^(1))同时混合,于pFP后或前3日及分左、右侧胫前肌注射4种方式。第2批为不同剂量的pFP与一定剂量(10μg.只^(-1))的pS_2.S混合共注射。第3批为不同剂量pS_2.S与pFP按1:1混合共注射免疫实验。结果:pFP与pS_2.S混合共注射免疫效果最佳,以此方式改变pFP剂量联合pS_2.S免疫2、4周时,血清抗-HBs阳性例数及水平以2者剂量按1:1配伍为最高,按此配伍免疫4周时,高(H)、中(M)、低(L)剂量组血清抗-HBs阳性率均为100％,而L组血清抗-HBs水平(51.1±23.8)mIu·ml^(-1)均较M组(217.4±64.1)mIu·ml^(-1)及L组(212.1±124.6)mIu·ml^(-1)低,差异具有显著性(t=7.168,P<0.01;t=2.838,P<0.05)。联合免疫接种2天后,分离采集各组10只小鼠局部引流淋巴结(LN),淋巴细胞及树突状细胞(DCs)计数结果,pS_2.S+pFP组DCs密度及其占LN细胞的百分比均较pS_2.S+pcDNA3.1组高。结论:pFP与pS_2.S剂量按1:1配伍混合共注射免疫效果最佳,pFP可能通过促进局部组织抗原呈递功能较强的DCs的增殖及活性而达到其佐剂效应。

IL-2/IFN-γ融合蛋白质粒增强HBV DNA疫苗免疫原性的实验研究(英文)

目的评价IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒(pFP)增强HBV DNA疫苗(pS2.S)免疫原性的佐剂作用。方法构建IL-2/IFN-γ融合蛋白和HBV包膜中蛋白(PreS2+S)编码基因的重组真核表达质粒,根据pFP编码的目的基因序列分子模拟IL-2/IFN-γ融合蛋白的空间结构,检测质粒体外转染细胞表达目的基因产物及其生物活性;体内实验采用提高质粒转染效率的在体电脉冲(EP)技术免疫健康BALB/c小鼠,分别以ELISA及免疫酶联斑点(ELISPOT)方法检测小鼠血清抗HBs及脾脏HBsAg特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞应答水平。结果pFP能够以融合蛋白的形式正确表达IL-2和IFN-γ,其活性域保持相对独立,其分子模拟的结果得到了质粒体外细胞转染检定实验的证实。EP介导的HBV DNA免疫反应中,pS2.S+pFP组血清抗-HBs[(51.2±50.5)mIU/mL,89%]及HBsAg特异性分泌IFN-γ的淋巴细胞应答[(207±103)IFN-rT细胞SFCs/3×105脾细胞,78%]水平和阳性率均显著高于pS2.S+pcDNA3.1组[抗-HBs:(14.8±7.6)mIU/mL,64%;IFN-γT细胞:(84±70)SFCs/3×105脾细胞,28%](P<0.05)。结论实验结果提示Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ的融合蛋白基因表达质粒可提高HBV DNA疫苗的免疫效果,并促进初始T细胞向Th1方向分化。

HBV DNA疫苗诱导健康及HBV转基因小鼠细胞免疫应答

采用HBVCTL表位多肽体外刺激或冲击免疫效 (E)、靶(T)细胞 ,以观察DNA疫苗诱导健康及HBV转基因 (Tg)小鼠细胞免疫效果。结果发现 ,DNA疫苗能有效诱导健康BALB/c小鼠CTL活性 ,活性强弱与E/T比值及其上清液中IFN γ分泌水平有一定关系。HBsAg表位多肽(pp2 0 )体外刺激DNA疫苗免疫组效应细胞 ,培养上清IL 1 2释放水平 (2 1 1 3± 39 8pg/ml)明显较对照组 (86 7±2 7 1 pg/ml)高(P <0 0 5 ,t=4 4 82 )。DNA疫苗免疫HBVTg小鼠诱导CTL活性 (1 2 7%± 6 7% )较蛋白疫苗免疫对照组(1 7%±3 2 % )高(P <0 0 1 ,t=3 6 2 9) ;其效应细胞体外受 pp2 0刺激后分泌IL 1 2水平 (4 0 0± 30 1pg/ml)明显高于同期空载体免疫对照组 (3 8±3 0 pg/ml,P <0 0 5 ,t=2 376 )。采用在体电脉冲法DNA疫苗接种的 5只HBVTg小鼠中 ,于 4周时有 2只血清HBsAg阴转 ,并于 8周时出现抗 HBs阳性 ,而对照组中无一例血清HBsAg发生变化。表明HBVDNA疫苗能有效诱导健康及HBVTg小鼠细胞免疫应答 。

人神经生长因子基因在大肠杆菌中的表达

目的 为进一步研究神经生长因子 (β- NGF)及其基因的结构及功能奠定基础。方法 自行设计合成一对特异引物 ,直接从人血细胞基因组 DNA中 PCR扩增出 NGF基因片段 ,克隆至 p GEM- T Easy载体 ,p GEM- T- NGF克隆片段再定向插入原核表达载体 p GEX- 5 T,构建的重组体 p5 TNF转化大肠杆菌 JM10 9并经IPTG诱导表达。结果 经限制性酶谱和 DNA测序确证 ,p GEM- T- NGF克隆片段为 β- NGF全长编码序列(380 bp) ;SDS- PAGE、分光光度计扫描和 Western印迹显示 ,p5 TNF转化菌有 40 .5× 10 3u特异区带 ,融合蛋白表达量为 5 0 3.2 mg/ L,占菌体可溶性蛋白总量 (7.4g/ L) 6 .8% ,该产物具 NGF抗原活性。结论 本研究成功克隆 β-NGF基因全长编码序列并在大肠杆菌中获稳定表达 ,同时证实国人 β-

老年期痴呆患者血清Tau蛋白免疫印迹分析

目的 探讨血清Tau蛋白水平对老年期痴呆患者临床诊断的意义.方法 应用单克隆抗Tau蛋白抗体(Anti-Tau l)和免疫狭缝印迹(ISB)技术对112例老年期痴呆患者[Alzheimer病(AD)75例、多发性梗塞性痴呆(MID)37例]和24名年龄配对的老年健康人的血清测定Tau蛋白水平,用分子分析仪并联计算机(IBM)扫描进行分析,血清Tau蛋白的相对浓度以校准强度(CI)表示.结果 本研究显示老年期痴呆患者组的血清Tau蛋白含量(CI值:总计=0.114±0.03,AD=0.110 ±0.03,MID=0.123 ±0.04)与对照组(CI值为0.116±0.04)的差异无显著性(P值均>0.05),也不受有或无apo E_4等位基因(∈_4)的影响.结论 在临床上诊断老年期痴呆时,有必要采用相同技术对脑脊液(CSF)中的和血清中的Tau蛋白进行同步分析比较.

大鼠暴发性肝功能衰竭型肝性脑病血浆γ-氨基丁酸浓度变化的实验研究

作者采用放射受体分析法,测定D-氨基半乳糖(GalN)复制的暴发性肝衰大鼠模型其血浆γ-氨基丁酸(GABA)浓度的动态变化。结果表明:注射GalN后,随大鼠病情加重,GABA浓度随之增高,二者呈平行关系(r=0.9443,P<0.05)。48小时出现肝性脑病时,GABA浓度达到高峰,为注射前8倍。提示:肝衰动物血浆GABA浓度增高与肝性脑病发病有关。

轴突引导分子

在神经系统发育或再生过程中，神经元轴突生长锥形成、延伸并与靶细胞形成突触连接，依赖微环境中的多种引导分子吸引或/和排斥作用。近年确定的轴突引导分子要有导素、信号素、Epb相关受体酪氨酸激酶配体和细胞粘附分子等，研究这类分子的作用，将有助于阐明神经系统的发育、网络形成及损伤后再生修复的机理。

生大黄在治疗暴泼性肝衰型肝性脑病中的效果及其机理的实验探讨(摘要)

作者在腹腔注射D—氨基半乳糖(GalN) 于Wistar雄性大鼠复制的暴发性肝衰型肝性脑病模型上用生大黄煎液灌胃治疗,观察疗效并用放射受体分析法动态测定了动物血浆GABA浓度变化。结果表明:肝衰组动物,在GalN注射后,随病情加重,血中GABA随之增高。

猪可控心肌缺血模型

猪可控心肌缺血模型成都华西医科大学病理生理教研室（成都６１００４１）李洵，王树人，沈学宁，黄宁，何晓嫱轻、中度心肌缺血是远比心肌梗死更常见的病理过程，而目前国内常用的急性动物实验模型多采用结扎某一支冠脉，以造成完全的阻塞。但轻、中度缺血和完全梗塞在许...

IL-2/IFN-γ融合蛋白基因质粒联合HBV DNA疫苗治疗HBV转基因小鼠效果评价

目的评价融合蛋白基因质粒(pFP)联合在体电脉冲(EP)介导的HBVDNA疫苗(pS2.S)免疫HBV转基因(Tg)小鼠的治疗效果。方法HBVTg小鼠随机分成3组,每组5只,分别为pS2.S+pFP、pS2.S+pcDNA3.1免疫治疗和pcDNA3.1对照组,联合免疫质粒总剂量40μg/只,按1∶1比例混合接种。初次免疫后第4、8周分别进行第一、二次增强免疫,免疫前后分别检测血清学、组织学及HBV特异性免疫应答。结果HBVDNA血清定量检测结果,pS2.S+pFP组免疫第8周(13317±2539)拷贝/ml、第12周(6462±3359)拷贝/ml时分别较免疫前(36159±7769)拷贝/ml明显减低,差异具有统计学意义(P<0.01);pS2.S+pcDNA3.1组第4周(20618±9523)拷贝/ml及第8周(23818±5319)拷贝/ml时均较其免疫前水平(36090±4421)拷贝/ml明显降低(P<0.01),但不能持续到12周(27691±13071)拷贝/ml,并明显高于此时pS2.S+pFP组水平,差异有统计学意义(P<0.01);观察终点(12周)pS2.S+pFP组Tg小鼠个体血清HBVDNA及肝组织HBsAg表达水平降低的同时,伴随其血清ALT水平及HBsAg特异性IFN-γ分泌细胞数目的升高。结论Th1类细胞因子IL-2/IFN-γ融合蛋白基因表达质粒能够增强HBVDNA疫苗抑制Tg鼠HBVDNA复制和表达的治疗作用。

HBV DNA疫苗阳离子脂质体复合物转染小鼠实验研究

目的:评价阳离子脂质体作为基因输送载体的效果及初步探讨其作用机理。方法:将二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)与1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)用超声法或挤压法制成阳离子脂质体多片层囊泡(MLV)或小单层囊泡(SLV)。MLV或SLV与DNA(pS2.S/pFP,1∶1)直接混合形成正负电荷比为3∶1或1∶3的阳离子脂质体/DNA复合物MLV-DNA或SLV-DNA。25只BALB/c平均小鼠分成五组:A,B,C,D,E。分别用4种阳离子脂质体/DNA复合物(A,B,D,E组)和10μg裸DNA(C组)一次性肌肉注射免疫接种小鼠。裸DNA、MLV-DNA(3∶1)和SLV-DNA(3∶1)分别与DNase I反应30 min后,1％琼脂糖凝胶110V电泳2 h分离鉴定DNA。结果:免疫接种后第2周,A组和B组血清转阳率均为40％;免疫接种后第4周,A组和B组血清转阳率均达到100％,并保持至第8周以后。免疫接种后第4周,A组血清平均抗-HBs滴度比对照的C组血清平均抗-HBs滴度高27倍(2.3706,0.9370,P<0.02)。免疫接种8周后,A组和B组小鼠血清抗-HBs水平仍呈上升趋势,平均抗体滴度分别是2.5687,1.9533。D组与E组小鼠血清未见转阳。与DNase温育30 min后,裸DNA(C组)被完全降解,而MLV-DNA(3∶1)和SLV-DNA(3∶1)中DNA基本保持完整。结论:阳离子脂质体是一种高效的非病毒基因输送介质;免疫接种后抗体持续高水平,可能是阳?

DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生

目的 :在HBVDNA疫苗成功地诱导健康小鼠体液免疫应答的基础上 ,探讨其作为抗 HBV治疗的可行性及作用机理。方法 :应用基因重组技术 ,构建编码HBV中蛋白 (preS2 +S)及人白细胞介素融合蛋白基因的真核表达质粒pS2 .S及pFP ,继经肌注免疫健康Balb C及HBV转基因 (Tg)小鼠并观察健康小鼠细胞免疫应答及HBVTg小鼠HBsAg的血清转换。结果 :1 体外HBsAg对DNA疫苗免疫后的T细胞的刺激呈浓度相关 ,HBsAg 30 μg ml时刺激pS2 .S免疫小鼠脾细胞增殖指数(5 6± 0 9)明显较pcDNA3 1组 (2 0± 0 5 )高。细胞培养上清液细胞因子水平检测结果 :免疫实验组IL 2及IFN γ的分泌水平明显较对照组高 ,而IL 4水平于各组影响不明显。 2 pS2 .S免疫小鼠局部引流淋巴结DCs诱导HBsAg致敏的T 细胞增殖指数(4 2 0 )较pcDNA3.1组 (2 5 5高 )。 3 高剂量的pS2 .S组与联合pFP组各有一只Tg小鼠分别于 2、4w开始发生HBsAg血清转换 ,且其抗体水平随时间而增长。结论 :结果表明HBVDNA疫苗能有效诱导HBsAg特异性的细胞免疫应答 ;HBV Tg小鼠初步实验结果为治疗型HBVDNA疫苗的深入研制提供了实验依据。

血液流变学因素对缺血心肌冠脉流量的影响

选用长白猪８只于麻醉下开胸，于在体猪心上探讨心肌缺血时冠脉仍保留有部分扩张储备，而未被充分利用的机理。实验结果表明：降低左冠状动脉前降支（ＬＡＤ）内压至４．６７ｋＰａ时，由ＬＡＤ分别输入腺苷、山莨菪碱、生理盐水（２ｍｌ／ｍｉｎ），皆能诱发出明显的ＬＡＤ流量增加（Ｐ＜０．０５）。在维持ＬＡＤ内压不变，并持续分别输入上述三种溶液的同时，从ＬＡＤ远端取血测血液流变学指标，结果显示，输入生理盐水和山莨菪碱使红细胞压积降低，血浆粘度和全血粘度下降；心肌缺血时，冠脉内输注药物所诱发出的“冠脉扩张储备”部分是由于此种给药方式所引起的血液稀释及血液粘度下降的结果。它提示在冠脉狭窄时，血液粘度对狭窄远端的心肌血供可能是一个相当重要的因素，降低血液粘度可能并不亚于扩血管药物的作用。