恶性疟原虫核糖核酸酶H2基因的重组质粒构建及其原核表达

目的构建恶性疟原虫(plasmodium falciparum,P.falciparum)核糖核酸酶H2(ribonuclease H2,RNase H2)编码基因的重组质粒并在E.coli中表达。方法应用PCR技术从P.falciparum 3D7 cDNA文库(MRA-297)扩增RNase H2编码基因片段,将其T-A克隆和测序,并与GenBank公布预测P.falciparum 3D7RNase H2(登录号PFF1150w)的基因序列进行同源比对,再将目的基因插入至表达载体pET23b中进行表达。结果 RNase H2基因全长为867 bp,与GenBank公布的RNase H2基因的同源性为99%,表达的RNase H2蛋白的相对分子质量(Mr)为33 000。结论重组RNase H2能在E.coli中高效表达,为研究此蛋白在P.falciparum DNA复制中的作用奠定了基础。

胰高血糖素样肽-1抑制高糖和高胰岛素诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化损伤

目的 观察胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对高糖高胰岛素诱导主动脉内皮细胞损伤的保护作用,并揭示其机理.方法 原代培养正常成年SD大鼠胸主动脉内皮细胞,将细胞分为五组,即（A）正常糖（5.5 mmol/L）组,（B）高糖（25 mmol/L）组、（C）高糖±GLP-1（10 nmol/L）组,（D）高糖＋高胰岛素（100 nmol/L）组和（E）高糖高胰岛素±GLP-1组.采用DAPI染液检测发生凋亡改变的细胞,各组细胞凋亡率=（凋亡改变的细胞数/总细胞数）×100％;采用比色法检测细胞内caspase-3和SOD1,SOD2的相对酶活性（A实验组/A对照组）;采用流式细胞术检测细胞中活性氧自由基（ROS）的相对含量（平均荧光强度）,并通过荧光定量PCR对细胞中NADPH氧化酶的亚基p22phox以及SOD1,SOD2和过氧化氢酶的mRNA转录水平进行检测（RQ值）.结果 ①B组和C组细胞的凋亡率分别为（36.9±5.90）％和（20.5±3.39）％,两者相比差异具有统计学意义（P=0.035）;D组和E组细胞的凋亡率分别为（52±8.14）％和（17.52±0.68）％,两者相比差异具有统计学意义（P=0.017）;②caspase-3相对酶活性在B组和C组中分别为1.50±0.07,1.06±0.03,两者相比差异具有统计学意义（P=0.000）,在D组和E组中分别为1.77±0.08和1.22±0.07,两者相比差异具有统计学意义（P=0.000）;③ROS的相对含量在B组和C组中分别为1.50±0.11,0.52±0.10,两者相比差异具有统计学意义（t=6.844,P=0.000）;④B组中SOD2和过氧化氢酶的mRNA转录水平（1.06±0.06,1.04±0.22）均低于C组（1.33±0.10,1.77±0.16）,差异具有统计学意义（P=0.002和0.018）,D组中SOD2和过氧化氢酶的mRNA转录水平（1.08±0.13,1.02±0.15）均低于E组（1.27±0.06,1.58±0.17）,差异具有统计学意义（P=0.022和0.020）;B组和D组分别与C组和E组相比,p22phox和SOD1的mRNA转录水平差异不具有统计学意义（P＞0.05）;⑤SOD2的相对酶活性在B和C组中分别为0.82±0.02和1.03±0.07,两者相比差异具有统计学意义（P=0.040）,在D和E组中分别为0.78±0.06和0.96±0.05,两者相比差异具有统计学意义（P=0.033）;SOD1的相对酶活力在各组中的差异不具有统计学意义（F=0.677,P=0.618）.结论 GLP-1能降低大鼠主动脉内皮细胞中ROS的含量,抑制细胞凋亡,能有效抑制高糖和高胰岛素对内皮细胞的损伤.

幽门螺杆菌Lpp20融合蛋白的表达、标签切除及鉴定

目的:利用GST融合基因表达系统表达Lpp20-GST融合蛋白,并利用凝血酶切除GST标签。方法:IPTG诱导重组质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,菌体经反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌后,发现Lpp20-GST融合蛋白以部分可溶性的形式表达。采用GST蛋白纯化系统对其纯化,得到Lpp20-GST融合蛋白,再用凝血酶进行GST标签的切除,所得产物进行Western Blot鉴定。结果:高效表达出Lpp20-GST融合蛋白的相对分子质量约4.5kDa,凝血酶成功切除了GST标签,Western Blot证实Lpp20蛋白能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论:成功表达和纯化了重组Lpp20蛋白,为深入研究Lpp20的功能奠定了基础。

柱上切除GST标签制备幽门螺杆菌Lpp20蛋白

目的表达幽门螺杆菌Lpp20-GST融合蛋白,获取切除GST标签的重组蛋白。方法采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组表达质粒Lpp20/pGEX-4T-1在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,收集菌体并采用反复冻融、溶菌酶裂解及超声破菌3种细胞破碎方法,表达产物在谷胱甘肽琼脂糖树脂4B柱上纯化,利用凝血酶切除GST标签,用鼠抗Lpp20单克隆抗体进行纯化产物western blot鉴定。结果高效表达出Lpp20-GST融合蛋白,相对分子质量约为4.5 kDa,产物以部分可溶性形式表达,凝血酶成功切除GST标签,纯化产物能被鼠抗Lpp20单克隆抗体识别。结论凝血酶柱上切除GST标签获得目的蛋白。