基于代谢组学探讨金水尘肺方改善二氧化硅诱导大鼠矽肺肺纤维化的作用机制研究

目的从内源性代谢物变化途径探讨金水尘肺方改善二氧化硅(SiO_(2))诱导的矽肺纤维化的作用机制.方法将32只SPF级雄性SD大鼠按随机数字表法分为正常对照组、模型组、金水尘肺方组(9.72 g·kg^(-1)·d^(-1))、汉防己甲素组(27 mg·kg^(-1)·d^(-1)).采用一次性非暴露式气管滴注SiO_(2)混悬液(250 mg/kg)的方法制备矽肺模型大鼠;制模后5~8周给予相应药物灌胃.第8周末,检测各组大鼠用力肺活量(FVC)、潮气量(TV)以及肺动态顺应性(Cydn)的变化;采用苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色观察各组肺组织病理学改变,并采用Szapiel评分标准和Ashcroft评分标准评价病灶肺泡炎、纤维化程度;采用免疫组化法检测Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(COLⅢ)的阳性染色;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达水平.进一步采用超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MS)技术对大鼠血清样本进行差异代谢物筛选,并基于代谢分析网站MetaboAnalyst 5.0进行通路分析.结果与正常对照组比较,模型组大鼠肺组织出现明显病理学损伤,表现为肺泡结构完整性被破坏,纤维结节包裹SiO_(2)颗粒,肺泡炎评分和肺纤维化评分均明显升高[肺泡炎评分(分):2.62±0.27比0.20±0.15,肺纤维化评分(分):5.42±0.66比0.50±0.84,均P<0.01],肺功能指标Cydn、FVC和TV均明显降低[Cdyn(mL/cmH_(2)O):0.26±0.03比0.33±0.03,FVC(mL):8.09±0.47比10.99±0.38,TV(mL):1.95±0.19比2.53±0.26,均P<0.01];肺组织COLⅠ、COLⅢ阳性染色和α-SMA、FN、TGF-β1的蛋白表达水平均明显升高[COLⅠ(A值):13.47±1.76比5.77±0.45,COLⅢ(A值):10.39±0.47比6.19±0.77,FN蛋白表达(FN/GAPDH):0.33±0.02比0.21±0.07,α-SMA蛋白表达(α-SMA/GAPDH):1.78±0.16比1.11±0.24,TGF-β1蛋白表达(TGF-β1/GAPDH):0.52±0.10比0.11±0.46,均P<0.01].与模型组比较,金水尘肺方组和汉防己甲素组肺组织病理形态明显改善,肺泡炎和肺纤维化评分明显降低[肺泡炎评分(分):1.10±0.15、1.33±0.31比2.62±0.27,肺纤维化评分(分):3.50±0.45、4.33±0.98比5.42±0.66,均P<0.01];肺功能指标Cydn、FVC、TV均明显升高[Cdyn(mL/cmH_(2)O):0.32±0.05、0.31±0.04比0.26±0.03,FVC(mL):9.41±0.85、8.70±0.92比8.09±0.47,TV(mL):2.70±0.19、2.27±0.15比1.95±0.19,均P<0.05];肺组织COLⅠ、COLⅢ阳性染色和FN、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均明显降低[COLⅠ(A值):7.09±0.67、8.13±0.64比13.47±1.76,COLⅢ(A值):8.19±0.66、8.52±0.22比10.39±0.47,FN蛋白表达(FN/GAPDH):0.19±0.06、0.24±0.03比0.33±0.02,α-SMA蛋白表达(α-SMA/GAPDH):0.89±0.41、0.88±0.08比1.78±0.16,TGF-β1蛋白表达(TGF-β1/GAPDH):0.04±0.03、0.06±0.01比0.52±0.10,均P<0.05].代谢组学分析显示,正常对照组、模型组、金水尘肺方组之间鉴定的主要差异代谢物共有10种,包括花生四烯酸、棕榈酸、吲哚-3-乙酸、丙酰肉碱、(S)-4-羟基扁桃腈、萘啶酮酸、苯佐卡因、芦竹碱、4-乙基苯酚、N-苄基甲酰胺.金水尘肺方可回调矽肺大鼠的部分异常代谢,包括不饱和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、脂肪酸伸长率、脂肪酸的降解与生物合成.结论金水尘肺方可以有效改善SiO_(2)诱导的矽肺纤维化,其作用机制主要与调节不饱和脂肪酸的生物合成、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、脂肪酸伸长率、脂肪酸的降解与生物合成有关.

保金尘肺方通过mTORC2-AKT-IRF4信号通路抑制巨噬细胞M2极化改善矽肺肺纤维化的作用机制

目的:基于mTORC2-AKT-IRF4信号探讨保金尘肺方抑制巨噬细胞M2极化改善二氧化硅(SiO_(2))诱导矽肺作用机制。方法:32只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、汉防己甲素组(27 mg·kg^(-1)·d^(-1))、保金尘肺方组(9.72 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组8只。采用一次性非暴露式气管滴注SiO_(2)混悬液(50 mg/mL)制备矽肺大鼠,于造模第7周予对应药物灌胃治疗,共2周。检测大鼠肺功能;HE染色和Masson染色观察肺组织病理改变和胶原沉积;免疫组化法检测Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)、CD68、CD206和转化生长因子-β1(TGF-β1)的表达;免疫印迹法检测CD206、精氨酸酶(ARG)-1、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、AKT、p-mTOR^(ser2481)、p-AKT^(ser473)和干扰素调节因子4(IRF4)蛋白表达;Real-time PCR检测CD206和ARG-1 mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠肺功能VC、TV、Cdyn和Cchord均显著下降(P<0.01);大鼠肺泡结构破坏,大量炎性细胞浸润;肺组织COL-Ⅰ、COL-Ⅲ以及M2巨噬细胞标志物CD68、CD206和促纤维化因子TGF-β1的表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,保金尘肺方组大鼠肺功能VC、TV、Cdyn和Cchord均显著升高(P<0.05,P<0.01),汉防己甲素组VC、TV、Cdyn均显著升高(P<0.01)。保金尘肺方组和汉防己甲素组肺组织病理明显改善,COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及M2巨噬细胞标志物CD68、CD206和促纤维化因子TGF-β1表达显著降低(P<0.01)。此外,IL-4诱导肺泡巨噬细胞M2极化标志物CD206、ARG-1 mRNA和蛋白,以及mTORC2信号蛋白p-mTOR^(ser2481)、p-AKT^(ser473)、IRF4表达显著升高(P<0.05,P<0.01);而保金尘肺方高浓度可以显著抑制IL-4诱导肺泡巨噬细胞的M2标志物的mRNA和蛋白及mTORC2信号磷酸化蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:保金尘肺方可以改善SiO_(2)诱导的矽肺大鼠肺纤维化,其机制可能与抑制mTOR/AKT通路,阻抑巨噬细胞M2极化有关。