基于CRISPR/Cas9技术电转建立RAW264.7巨噬细胞Mincle敲除株及其对炎症响应的变化研究

目的:采用高效基因电转法,通过电转CRISPR/Cas9质粒建立巨噬细胞可诱导性C型凝集素(Mincle)敲除的RAW264.7巨噬细胞系,并探讨Mincle敲除对脂多糖刺激下巨噬细胞炎症的影响。方法:对融合度为80%的RAW264.7巨噬细胞实施px-458-Mincle质粒电转。电转后24 h观察荧光效果,并通过流式细胞分选仪得到荧光阳性细胞,挑选并培养出36个克隆测序,最终鉴定出敲除成功的细胞系。提取RNA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达,以及巨噬细胞极性标志物iNOS和CD206的表达。结果:摸索多个NEPA21电转仪对RAW264.7细胞电转条件,结果显示(300 V,5 ms)电转效果最佳,最高转染率高达30.7%。挑选的36个细胞克隆通过测序显示,突变率为58.33%,纯合子突变率为22.22%,敲除成功率为16.67%(缺失碱基数非3的倍数)。Western blot和免疫荧光检测验证Mincle蛋白表达缺失,说明敲除成功。与未敲除细胞相比,Mincle敲除细胞在脂多糖(100 ng/ml)刺激下,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的表达显著降低(P<0.001),抑制炎症的因子IL-10表达增加(P<0.01),M1型巨噬细胞标志物iNOS表达显著降低(P<0.001),M2型巨噬细胞标志物CD206则大幅增加(P<0.001)。结论:高效电转仪NEPA21可用于免疫细胞等难转细胞的转染。Mincle在巨噬细胞中的敲除能显著降低脂多糖刺激的细胞炎症,提示Mincle在巨噬细胞炎症中的重要作用。