金黄色葡萄球菌CCT融合蛋白的表达及免疫活性研究

利用前期筛选的具有良好免疫原性的S.aureus表面Clfa蛋白免疫优势片段Clfais和TraP蛋白的融合重组蛋白,加入CTB分子内佐剂,以表达CTB-Clfais-TraP(CCT)蛋白和研究CCT免疫活性。实验采用重叠PCR方法将分子内佐剂CTB与Clfais-TraP基因串联,并将CTB-Clfais-TraP插入到表达载体p ET32-a(+)上,构建p ET32-a(+)-CTB-Clfais-TraP重组质粒,经鉴定后,重组质粒转化到大肠埃希菌BL21中表达目的蛋白,利用Western blot方法对其鉴定,以ELISA方法检测CCT蛋白的免疫活性。实验结果表明表达的CCT蛋白大小为87.6 ku,CCT能与Clfais、TraP免疫小鼠血清发生反应,表明CCT具有免疫活性,不受CTB分子影响,这为进一步研究CTB提高Clfais-TraP蛋白的免疫活性奠定了良好基础。

含有分子内佐剂的CIC蛋白表达及免疫活性初步研究

为了研究含有分子内佐剂的CTB-IsdBid-Clfais(CIC)蛋白表达及其免疫活性,试验采用重叠PCR方法将分子内佐剂CTB与IsdBid-Clfais基因串联,并将CTB-IsdBid-Clfais(CIC)插入到表达载体pET-32a(+)中,构建pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒,将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中表达目的蛋白CIC,利用Western blotting方法对其进行鉴定,并以ELISA方法检测CIC蛋白的免疫活性。结果发现,试验成功扩增了2 072bp的目的基因CIC,并将CIC正确连接到pET-32a(+)载体上,构建了pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒;Western blotting结果证实,该重组质粒能够在大肠杆菌BL21感受态细胞中正确表达CIC蛋白,分子质量大小为95.9ku;ELISA结果显示,CIC试验组与IsdBid、Clfais蛋白组间均无显著差异(P>0.05),与BSA组间差异极显著(P<0.01)。综上所述,本研究成功构建了pET-32a(+)-CTB-IsdBid-Clfais重组质粒,该质粒在大肠杆菌BL21中成功表达了CIC蛋白,且CIC能与IsdBid、Clfais免疫小鼠血清发生反应,具有较强的免疫活性。