不同浓度铁离子对成骨细胞铁离子通道蛋白的影响

目的铁过载与骨代谢相关,在人成骨细胞(hFOB1.19)中,膜转铁蛋白(FPN1)、转铁蛋白受体(TfR)和二价金属转运蛋白1(DMT1)是细胞内铁离子进入和排除的重要通道蛋白;本研究用不同浓度铁离子干预成骨细胞培养,观察成骨细胞铁离子通道蛋白基因表达变化和相互联系,了解铁过载对相关通道蛋白的影响意义。方法人成骨细胞在34℃下进行体外培养,以不同浓度枸橼酸铁铵FAC(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)干预成骨细胞培养,48小时后收集细胞,按不同干预组抽提总RNA,采用半定量RT-PCR法检测成骨细胞中TfR、DMT1、FPN1 mRNA的表达。结果①RT-PCR检测显示不同浓度FAC干预成骨细胞后,各组FPN1、TfR、DMT1 mRNA均有表达;②不同浓度组FPN1、TfR、DMT1 mRNA表达光密度比值不同,组间密度比值比较存在统计学意义(P<0.05);③培养环境铁离子浓度增高可以使得FPN1的mRNA表达上调,而TfR、DMT1的mRNA表达下调。结论成骨细胞的铁通道蛋白受环境铁离子影响,在一定范围内随着细胞外铁离子浓度增加,细胞膜铁离子进入通道功能下调、排除通道功能上调,说明铁过载对成骨细胞内铁离子水平有明显影响。

高铁环境下成骨细胞增殖和凋亡与氧化应激的关系

目的了解高铁环境对人成骨细胞(hFOB1.19)增殖和凋亡的影响,观察其与氧化应激的关系。方法 34℃条件下体外培养hFOB1.19,以不同浓度(50、100、200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预48h后,用MTT法检测成骨细胞增殖活性;用流式细胞仪检测成骨细胞凋亡情况;分别用丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒检测成骨细胞MDA含量及SOD、GSH-PX活性。结果用不同浓度FAC干预成骨细胞48h后,FAC50、100和200μmol/L干预组细胞增殖活性分别为(0.63±0.02)、(0.55±0.03)和(0.46±0.04),均显著低于对照组(0.69±0.04),呈剂量依赖性;FAC50、100和200μmol/L干预组细胞凋亡率分别为(6.98±0.84)%、(11.82±0.66)%和(15.78±0.95)%,均显著高于对照组[(3.71±0.43)%],呈剂量依赖性升高,差异有统计学意义(P<0.05);成骨细胞脂质过氧化物MDA水平呈剂量依赖性升高,成骨细胞抗氧化物酶SOD及GSH-PX活性呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高铁环境可抑制成骨细胞增殖,促进成骨凋亡,其作用机制与氧化应激有一定相关性。

铁过载对成骨细胞铁稳态及生物活性的影响

目的了解铁过载对成骨细胞铁稳态及生物活性的影响。方法 34℃条件下体外培养人成骨细胞(hFOB1.19),以不同浓度(50、100、200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用RT-PCR检测成骨细胞铁调节基因膜转铁蛋白(FPN1)、转铁蛋白受体(TfR)和二价金属转运蛋白1(DMT1)表达的变化;用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察成骨细胞铁离子荧光强度;流式细胞仪检测成骨细胞活性氧(ROS)水平;碱性磷酸酶活性试剂盒检测碱性磷酸酶活性;Vonkossa染色法行钙结节染色。结果与对照组相比,FAC干预48h后FPN1mRNA的表达随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性上调,TfR、DMT1mRNA的表达呈剂量依赖性下调(P<0.05);FAC干预48h后成骨细胞铁离子荧光强度剂量依赖性减弱,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);48h后成骨细胞ROS水平随FAC干预浓度增加呈剂量依赖性升高(P<0.05);FAC干预10d后各组成骨细胞碱性磷酸酶活性均随FAC浓度增高而降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,FAC干预17d后成骨细胞钙结节染色显示矿化面积和钙结节形成随FAC浓度增加而减少。结论铁过载对成骨细胞生物活性有明显抑制作用,其机制可能与细胞内铁离子浓度增加及活性氧水平升高有关。

铁螯合剂在铁过载骨质疏松症中应用前景

骨质疏松症研究是骨科领域一项重要研究课题,骨代谢研究是重中之重。近年大量基础和临床试验研究显示,过多的铁离子可能通过抑制成骨细胞增值、分化促进破骨细胞分化及其功能,引起骨质疏松症。临床祛铁药物铁螯合剂可与铁离子形成大分子复合物而促进铁离子排泄,降低体内铁离子水平及其在各器官组织中的病理性沉积,因而可能具有防治铁过载骨质疏松症的潜在作用。

活性氧在铁过载影响成骨细胞生物活性中的作用

目的观察铁过载对人成骨细胞(hFOB1.19)生物活性的影响,同时观察活性氧在这一实验变化过程中的作用。方法体外培养成骨细胞,一组运用200μmol/L枸橼酸铁铵(FAC)干预,一组运用2.5 mmol/L抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预,一组NAC预处理1 h后运用相同浓度FAC干预,一组为正常对照;细胞培养48 h后,流式细胞仪检测各组细胞内活性氧(ROS)的水平;CCK-8法检测各组细胞活力;RT-PCR法检测各组细胞OPG、BGP和COL1 mRNA表达的变化;碱性磷酸酶活性试剂盒检测各组细胞碱性磷酸酶活性。结果不同干预组成骨细胞内活性氧含量差异显著不同(P<0.05),FAC组显著高于对照组,FAC+NAC组低于FAC组、高于NAC组;各组间活性氧含量的变化与成骨细胞活力、OPG、BGP和COL1 mRNA表达光密度比值、碱性磷酸酶活性呈负相关性,组间比较有统计学差异(P<0.05)。结论铁过载降低成骨细胞生物活性可能与铁过载增加成骨细胞内活性氧水平有关。

高铁培养环境对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化的影响

目的观察高铁培养环境下小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1增殖、分化指标的变化趋势,探讨铁离子对成骨细胞增殖、分化的影响。方法小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1在37℃条件下体外培养,在10 mmol/Lβ-甘油磷酸和50μg/mL抗坏血酸的诱导分化的作用下,分化为成骨细胞,同时用不同浓度(50、100、200μmol/L)枸橼酸铁铵(FAC)干预,用MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR法检测成骨细胞分化基因成骨相关转录因子(Runx2)、锌指结构转录因子(Osterix)、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨钙素(OC)的表达,碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测细胞碱性磷酸酶活性。结果 MC3T3-E1细胞的增殖活性、成骨分化相关基因的表达以及ALP水平随FAC干预浓度的增加呈剂量依赖性降低(P<0.05)。结论高铁培养环境可明显抑制小鼠前成骨样细胞MC3T3-E1的增殖和分化。

雌激素减少对大鼠铁代谢的影响

目的在机体,铁调素(Hepcidin)、膜转铁蛋白(FPN)、二价金属转运蛋白1(DMT1)、十二指肠色素b(DCYTB)是调节铁代谢的重要通道蛋白;本研究通过观察大鼠去势后铁代谢相关通道蛋白基因表达的变化,探讨雌激素与铁代谢的关系。方法雌性大鼠12只,随机分为2组:一组大鼠切除双侧卵巢(去势组),一组切除卵巢周脂肪(对照组),12 w后取标本检测观察;观察指标:①酶联免疫吸附法(Elisa)检测雌二醇浓度,②全自动生化分析仪检测大鼠血清铁,③电感耦合等离子体发射光谱仪原子吸收法检测鼠胫骨铁含量、肝组织铁含量,④半定量RT-PCR法检测肝脏Hepcidin、FPN的表达,以及十二指肠FPN、DMT1、DCYTB的mRNA的表达。结果去势组3项指标(雌二醇19.45±2.28 ng/L、血清铁36.36±9.34μmol/L、胫骨铁含量41.00±5.59μg/g)比对照组相应指标(雌二醇34.98±4.48 ng/L、血清铁54.73±11.08μmol/L、胫骨铁含量66.92±21.94μg/g)显著降低(P<0.05);去势组肝脏铁含量(750.20±94.08μg/g)比对照组(369.60±61.87μg/g)显著升高(P<0.05);RT-PCR结果显示:两组均有肝脏Hepcidin和FPN mRNA表达,表达水平两组比较存在显著差异;两组均有十二指肠FPN、DMT1和DCYTB mRNA表达,其中FPN、DCYTB mRNA表达水平两组比较有显著性差异,DMT1两组比较无明显变化。结论大鼠去势后可以使调控铁代谢的基因通道发生改变,影响铁的摄入和分布。

铁调素对小鼠单核细胞RAW264.7向破骨细胞分化的影响

目的探讨铁调素对小鼠单核细胞株RAW264．7向成熟破骨细胞分化的影响。方法将不同浓度铁调素加入含有核因子KB受体活化因子配体（RANKL）的RAW264．7细胞培养基，24h后用CCK-8法检测细胞的增生活性；4d后对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色，光镜下观察；用RT—PCR法检测TRAP、组织蛋白酶K（CTK）、金属蛋白酶9（MMM-9）基因表达；用酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中TRAP-5b含量；24h后用共聚焦显微镜（CLSM）测定细胞内铁离子浓度。结果铁调素在0～800nmol／L浓度围内可增加RAW264.7细胞TRAP染色阳性数目，上调TRAP、CTK和MMP-9基因表达，增加上清液TRAP-Sb含量（P〈0．05），同时增加RAW264．7细胞内铁离子浓度（P〈0．05）。结论铁调素可以促进RAW264．7细胞向破骨细胞分化，其作用机制可能与铁调素增加细胞内铁离子有关。

铁离子对人成骨细胞RANKL/OPG基因及蛋白表达的影响

目的研究人成骨细胞(hFOB1.19)在不同铁离子状态下RANKL/OPG基因及蛋白的表达。方法成骨细胞株(hFOB1.19)在DMEM/F-12培养基培养传代至第3代后,用不同终浓度枸橼酸铁铵(50、100、200μmol/L)加入细胞培养基中干预24h,用RT-PCR方法和免疫印迹法(WesternBlot)检测干预后成骨细胞的RANKL、OPGmRNA和蛋白表达并计算RANKL/OPG比率。结果RT-PCR检测结果显示,对照组、50、100、200μmol/L组RANKL/OPGmRNA表达比分别为0.56±0.13、0.58±0.01、0.69±0.01、1.84±0.92;Westernblot结果显示,对照组、50、100、200μmol/L组RANKL/OPG蛋白表达比分别为0.82±0.66、0.82±0.64、1.09±0.11、1.25±0.14。统计学分析显示,在mRNA和蛋白水平,100和200μmol/L浓度的枸橼酸铁铵干预后RANKL/OPG比值明显高于对照组(P<0.05),50μmol/L枸橼酸铁干预后与对照组差异无统计学意义。结论不同浓度枸橼酸铁铵可以影响人成骨细胞RANKL/OPG基因及蛋白的表达,进而可能影响骨形成和骨吸收。

高铁与低铁环境对成骨细胞hFOB1.19膜铁转运蛋白1表达的影响

目的观察细胞培养液中加入铁离子或铁离子螯合剂后成骨细胞(hFOB1.19)膜铁转运蛋白1(FPN1)表达的变化,探讨铁离子浓度对成骨细胞FPN1表达的影响。方法将不同浓度的枸橼酸铁铵(FAC,50、100、200μmol/L)和去铁胺(DFO,5、10、20μmol/L)分别加入人hFOB1.19培养基,24h后用共聚焦显微镜(CLSM)测定细胞内铁离子浓度,用定量PCR、Westernblotting和免疫荧光法测定不同组别成骨细胞FPN1的表达并进行统计比较。结果用不同浓度的FAC和DFO干预20h后,成骨细胞内铁离子浓度随FAC浓度增加而增加,随DFO浓度增加而降低,组间差异有统计学意义(P<0.05);FPN1基因和蛋白表达随FAC浓度增加而增加,随DFO浓度增加而降低,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论高铁环境可上调FPN1表达,低铁环境可下调FPN1表达。FPN1表达量的改变可有效维持成骨细胞内铁离子浓度的平衡。

类风湿关节炎合并腰椎滑脱后路减压融合内固定围手术期失血分析

目的比较合并与不合并类风湿性关节炎(RA)的腰椎滑脱症患者腰椎后路减压融合术(PLIF)术中出血量、术后引流量及隐性失血(HBL),探讨RA患者术中HBL的相关因素。方法回顾性纳入2014年1月至2019年4月在菏泽市立医院接受治疗的50例合并RA的腰椎滑脱症患者(RA组),同时期筛选73例未合并RA的患者(NRA组)。分析比较两组基本信息、RA信息、手术情况以及出血量相关指标。以术中出血量、术后引流量和HBL作为主要结果;手术时间、术前术后血细胞比容(Hct)和血红蛋白(Hb)及其变化值、手术前后贫血数量、术后新发贫血数量、自体血和异体血输注量等作为次要结果。应用多元线性回归模型分析RA组HBL的相关因素。结果RA组男9例,女41例,年龄(62±7)岁;NRA组男11例,女62例,年龄(64±9)岁。RA组病程为(14.4±11.2)年,其中单药或联合口服改变病情抗风湿药(DMARDs)者最常见,两组在椎弓根螺钉数和椎间融合器置入上差异均无统计学意义,围手术期并发症发生率相当。两组在总失血量(TBL)、术中出血量和术后引流量等差异均无统计学意义[(693±315)ml比(630±365)ml、(454±373)ml比(414±375)ml和(653±376)ml比(675±400)ml,t=1.072、0.388、-0.189,均P>0.05],而HBL及HBL所占TBL比例在NRA组中更低(t=6.157、2.965,均P<0.05)。根据手术节段数进行分层分析,长节段(≥3节段)手术中NRA组中HBL和HBL所占TBL比例均优于RA组。次要结果对比Hct改变值在NRA组小于RA组(P=0.031),但两组Hb减小值差异无统计学意义(P>0.05);术后两组新发贫血以及贫血加重差异无统计学意义,异体血输注和手术时间差异也无统计学意义(均P>0.05)。RA的Steinbrocker级别高、未服用DMARDS、Hb变化和输注异体血为HBL的独立相关因素(β=0.363、-0.272、0.210、1.204,均P<0.05)。结论RA组和NRA组在TBL、术中出血、术后引流和手术时间上无差异,而HBL以及HBL所占TBL比例在RA组高于NRA组;RA组的Steinbrocker分级高、未服用DMARDs、Hb改变较多。