单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏感染期间LATs的活跃转录可能与其启动子与增强子两侧的CTCF结合序列有关。本研究对位于UL56下游与LAT启动子上游之间并与CTCF结合序列重叠存在的一个新开放读码框(本研究中命名为UL57)进行了鉴定。首先利用HSV-1(F)细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建重组病毒HSV-EGFP-UL57,将EGFP序列插入UL57 5’端;然后分别通过Northern Blot和Western Blot检测EGFP标记的UL57的转录和表达;同时构建敲除UL57的重组病毒HSV-ΔUL57,观察UL57对病毒增殖的影响。结果显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57感染HEp-2细胞17h后,EGFP探针检测到两条转录产物,其中1.8kb转录产物与预测大小相符;使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断病毒即刻早期蛋白/早期蛋白合成后,UL57转录受到明显抑制。重组病毒HSV-EGFP-UL57感染Vero细胞后,9h可见融合蛋白表达,24h表达明显;融合蛋白分子量与预测大小(58kD)一致。病毒生长曲线显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57及HSV-ΔUL57在Vero细胞中的增殖水平与HSV-1(F)基本一致。本研究表明,在HSV-1基因组(GenBank:GU734771.1)UL56下游与LAT启动子上游之间存在一个新开放读码框UL57(116 921bp～117 799bp),UL57可以进行转录,且其转录受病毒即刻早期蛋白/早期蛋白调控;转录产物可以翻译出融合蛋白,但表达水平较低。删除UL57对病毒增殖无明显影响。

tk1基因敲除Vero细胞株的建立及其在单纯疱疹病毒tk基因修复中的应用

利用单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)标准株F细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建的HSV重组病毒由于存在tk基因缺陷,无法表达胸苷激酶,影响病毒潜伏/激活,故需对该基因进行修复。为此,本研究建立了tk1基因敲除的Vero细胞株(tk1-Vero),并利用该细胞株建立了次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(Hypoxanthine-aminopurine-thymidine,HAT)选择性培养液筛选方法,对经同源重组方式完成tk基因修复的病毒进行筛选。首先,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Vero细胞tk1基因,通过有限稀释法建立tk1-Vero细胞株,采用DNA测序和Western Blot对tk1-Vero细胞株进行鉴定;比较HSV(F)和tk-HSV(F)在tk1-Vero细胞和tk基因缺陷的人骨肉瘤143细胞中的增殖情况;在tk1-Vero细胞中,采用HAT选择性培养液筛选方法,对tk基因修复病毒进行筛选。结果显示,本研究成功建立了稳定的tk1-Vero细胞株;与143细胞相比,tk1-Vero细胞更适于病毒增殖及tk基因修复病毒的筛选;最后在tk1-Vero细胞中,利用HAT选择性培养液成功筛选出tk基因修复病毒。本研究表明,采用tk1-Vero细胞株建立的HAT选择性培养液筛选方法可以对tk基因修复病毒进行高效快速筛选。