机器学习驱动中医诊断智能化的发展现状、问题及解决路径

本文对人工智能(artificial intelligence,AI)技术的机器学习算法,特别是传统机器学习和深度学习分析中医四诊信息以实现诊断智能化的应用和局限进行概述,并结合多源多模态信息处理、智能辨病辨证等探讨了智能诊断的发展现状,为智能决策的辅助诊疗提供基础。基于AI应用于中医诊断的适用性,分析目前中医诊断智能化赋能的技术难题,如缺乏四诊采集标准和大型带标注的先验数据集,缺乏多算法共建智能诊断模型的研究,以及对智能诊疗模型的疗效评价研究等,并详细分析解决路径,以期为中医诊断智能化应用提供发展方向。

基于“态靶结合”探讨温阳法治疗抑郁症

抑郁症是常见的精神疾病,属中医“郁证”的范畴,中医治疗主要以疏肝解郁为主,近年来的临床及临床前研究发现温阳法亦有良好的疗效。“态靶结合”将宏观“调态”和微观“打靶”相结合,发挥了中医整体观和西医精准化治疗的优势。从该角度出发,笔者认为抑郁症患者的心理和躯体特征与阳虚证相似,表现为“不足、低下”等表现,具有“阳虚”偏态,而以温阳为治疗大法的中药及针灸等治疗手段均可以纠正抑郁症的“偏态”。现代科学研究认为抑郁症有多种理化指标的变化,如单胺神经递质减少、细胞因子水平增加、神经内分泌失调等,而多种温阳类中药复方的临床前研究均已证明其可以调节抑郁症的相关症状及理化指标,具有微观“打靶”的作用。本课题组多年来致力于研究温阳法在治疗抑郁症中的重要性,在动物实验中通过与单纯的解郁法相比,温阳及温阳解郁法在行为学、神经炎症、突出可塑性等方面均具有更好的疗效。因此本文基于“态靶结合”对其治疗抑郁症的理论依据进行梳理,希冀对临床应用提供一定的参考价值。

证候动物模型研制的现状、瓶颈与发展路径探讨

证候动物模型是中医研究的重要实验手段,模型研制的理论、构建流程、评价方法等方面已初步具备了发展的基础条件,但现有模型仍存在中医特色不强、造模方法不成熟、缺少公认评价方法等问题。对证候本质的把握、种属间表征的差异、宏观表征与微观指标的关联等关键科学问题成为制约证候动物模型成功研制的瓶颈。应加强临床基础研究,阐释证候现代内涵;基于药(方)效和现代临床数据,建立证候动物模型评价规范;通过造模因素效应的动态、系统的研究,探索复合因素造模;建立中医证候动物模型表型库,明确模型病理过程。从基础证候模型研制入手进行协同攻关,才能取得突破性进展。

仙茅的临床应用及其用量探究

仙茅为石蒜科植物仙茅的干燥根茎,主要含有酚类与酚苷类、皂苷元与皂苷类、黄酮类、木脂素类、生物碱等成分[1]。淫羊藿性热味辛,归肝、肾、脾经,具有补肾阳、强筋骨、祛寒湿等功效。在精准辨证论治的前提下,中药剂量是疗效的根本保障。本文通过对运用仙茅的经典名方及古今名中医的临床经验进行整理分析,归纳其临床常用剂量、配伍规律、量效关系及所治疾病,为临床合理用药提供参考。

基于突触可塑性的抑郁小鼠证候生物学基础研究

目的通过观察母婴分离联合束缚应激诱导抑郁小鼠脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)-原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin receptor kinase,TrkB)-环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)通路与突触可塑性的变化,以及温阳、解郁和温阳解郁合方的调节作用,探讨抑郁小鼠证候生物学基础。方法小鼠出生后5~14 d给予母婴分离8 h/d,离乳后分为母婴分离(MS)组、模型(MS+RS)组、温阳(Wenyang)组、解郁(Xiaoyao)组、温阳解郁(XSF)组及阳性药(Fluoxetine)组,并以正常小鼠为对照(NC)组。NC、MS、MS+RS组小鼠以正常饲料喂养,Wenyang、Xiaoyao、XSF及Fluoxetine组小鼠分别给予二仙汤、逍遥散、温阳解郁方及盐酸氟西汀药混饲料,90日龄后除NC组连续给予21天3 h/d的束缚应激。采用糖水及旷场实验评估抑郁样行为,高效液相-电化学检测海马组织单胺类神经递质含量,免疫组化法观察突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein,PSD95)蛋白表达。实时荧光定量PCR法及Protein Simple分别检测海马组织BDNF、TrkB、CREB、PSD95及突触素(synapsin,SYN)的mRNA和蛋白表达水平。结果与NC组比较,MS+RS组小鼠糖水偏好指数显著下降(P<0.05),运动路程及中央区穿越次数显著减少(P<0.05);海马区5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、多巴胺(dopamine,DA)含量显著降低(P<0.01);BDNF、TrkB、CREB、PSD95与SYN mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05);海马CA1、CA3区PSD95表达显著减少(P<0.05)。与MS+RS组比较,3个中药干预组上述指标均有不同程度的改善,其中XSF组小鼠糖水偏好指数与Xiaoyao组5-HT含量均有极显著升高(P<0.01);各中药干预对海马BDNF、TrkB、CREB、PSD95及SYN mRNA表达均有显著调节作用,仅温阳与温阳解郁方对海马BDNF、CREB蛋白表达有极显著上调作用(P<0.01);中药各方及氟西汀对海马CA1区、温阳解郁方对CA3区PSD95表达的调节作用显著(P<0.01)。结论温阳与温阳解郁方对抑郁小鼠神经可塑性的影响显著,其可能通过BDNF-TrkB-CREB信号通路调节海马区突触可塑性,改善小鼠抑郁样行为,推测其证候生物学基础与阳虚有关。

早年不良经历证候基础探索

“早年”阶段是个体身心发展的关键时期,早年不良经历与抑郁症发生具有重要关联。课题组认为,幼儿“阳气易伤”是抑郁症常见病因,较早提出温阳解郁法治疗抑郁症,通过动物实验和调查问卷,论证了“阳虚肝郁”是早年不良经历所致精神行为异常的证候基础之一。在此基础上,利用不同环境刺激,探索了母婴分离模型行为学和神经生物学特点,并对“阳虚肝郁”证候形成中的“虚郁”转换的机制进行了进一步的设想,提出了应激诱导抑郁“滞-郁”“虚-郁”病机和证候转化假说,本文通过整理分析课题组基于温阳解郁法在情感发生和调节中的作用及相关机制的研究成果,以药示理,以方测证,为探索抑郁症的中医证候动态演变规律及内在机制提供借鉴。

温阳解郁方通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路对抑郁小鼠前额皮质自噬的影响

目的探讨温阳解郁方对抑郁小鼠前额皮质自噬水平的影响及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/m TOR)信号通路的调控作用。方法仔鼠出生后随机分为空白对照组12只、模型组60只,模型组采用母婴分离联合慢性束缚应激制备抑郁小鼠模型,离乳后随机分为模型组,温阳解郁方低、中、高剂量(8.35、16.70、33.40 g·kg^(-1))组和氟西汀(2.6 mg·kg^(-1))组,于离乳第21天至束缚完成第111天给予药混饲料干预。采用糖水偏好、悬尾实验和旷场实验评价小鼠焦虑抑郁行为;免疫组化法检测小鼠前额皮质泛素结合蛋白(p62)的表达;免疫荧光组织化学法检测自噬效应蛋白(Beclin-1)、自噬微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白的表达;Western Blot和Real-time PCR法检测PI3K/Akt/m TOR信号通路及自噬相关指标的蛋白和m RNA表达水平。结果行为学实验中,与正常对照组比较,模型组小鼠糖水偏好度、中央区活动时间及中央穿越次数明显降低,悬尾不动时间明显升高(P<0.01);与模型组比较,温阳解郁方中、高剂量组和氟西汀组小鼠糖水偏好度、中央区活动时间及中央穿越次数明显增加,悬尾不动时间明显缩短(P<0.05,P<0.01)。免疫组化、免疫荧光、Western Blot和Real-time PCR实验中,与正常对照组比较,模型组小鼠PI3K/Akt/m TOR信号通路和p62的蛋白及m RNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)、Beclin-1和LC3的蛋白及m RNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,温阳解郁方中、高剂量组和氟西汀组小鼠PI3K/Akt/m TOR信号通路和p62的蛋白及m RNA表达明显升高(P<0.05,P<0.01),Beclin-1和LC3的蛋白及m RNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。结论温阳解郁方可能通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路,降低前额皮质神经元和胶质细胞自噬水平,进而发挥抗抑郁疗效。

逍遥散对慢性轻度不可预见应激抑郁大鼠中枢多巴胺及其受体的影响

目的:从多巴胺(dopamine,DA)系统探讨逍遥散对慢性轻度不可预见应激抑郁模型大鼠的作用机制。方法:对SD大鼠施加慢性轻度不可预见应激14 d筛选出应激易感的24只大鼠,按随机数字表法随机分为模型组和逍遥散组,继续造模4周建立抑郁模型。造模期间逍遥散组每天给予逍遥散混悬液灌胃,另外设立空白组10只大鼠,给药4周后采用旷场、O迷宫实验观察各组大鼠行为学变化,液质联用(high performance liquid chromatography-mass Sp,HPLC-MS)方法检测前额皮质与伏核中DA及其代谢产物3,4-二羟基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacelic acid,DOPAC)、高香草酸(homovanillic acid,HVA)的浓度,荧光定量PCR和Western blot法检测前额皮质与伏核多巴胺受体1(dopamine receptor 1,D1R)、多巴胺受体2(dopamine receptor 2,D2R)、多巴胺转运体(dopamine transporter,DAT/SLC6A3)蛋白与mRNA表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠在旷场与O迷宫实验中活动性与探索性均显著下降(P<0.05,P<0.01),逍遥散表现出显著的上调作用(P<0.05,P<0.01)。模型组前额皮质与伏核中DA、DOPAC含量、伏核中HVA含量均明显低于正常组(P<0.05,P<0.01);模型组前额皮质及伏核中D1R mRNA和蛋白表达上升(P<0.01),D2R mRNA和蛋白表达下降(P<0.05),伏核中DAT mRNA和蛋白表达上升(P<0.05),逍遥散对以上指标均表现出较显著的调节作用(P<0.05,P<0.01)。结论:逍遥散对慢性轻度不可预见应激大鼠有较好的抗抑郁作用,其具体机制可能与逍遥散调节DA及其受体、转运体在中枢神经系统的表达有关。

逍遥散抗抑郁的药理学机制研究进展

抑郁症是目前高发的一种精神疾病,逍遥散是其常用的治疗方剂,其抗抑郁的药理学机制也在广泛研究当中。研究发现逍遥散可以通过提高脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表达水平、降低一氧化氮(nitric oxide, NO)含量、调节α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid receptor, AMPA)受体水平改善神经可塑性,调节单胺类神经递质等抑制免疫炎症反应,调控下丘脑—垂体—肾上腺轴(the hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA轴)及调节局部脏腑功能,如恢复胃肠功能、肝功能和修复血脑屏障通透性等多种途径实现抗抑郁治疗。本文通过总结逍遥散抗抑郁的药理学机制,发现多种机制之间不是独立存在,而是相互作用的,逍遥散对于每一条途径都有其调节作用,但能否影响多种途径间的相互作用,还有待于进一步深入研究和挖掘。故此,本文希望能为逍遥散抗抑郁的深层机制研究提供更多思路;为其临床治疗提供更多靶点,达到靶向治疗的目的,提高临床疗效,为逍遥散的研发提供更多方向和选择;充分发挥逍遥散的作用,展现中医药临床治疗的优势及特色。

阿魏酸对高脂血症小鼠肝脂肪变性及肠道菌群的调节作用

目的探讨阿魏酸(ferulic acid)对高脂血症小鼠肝脂肪变性及肠道菌群的调节作用。方法将24只6周龄雄性Apo E-/-小鼠随机分为4组(n=6),即对照组、模型组、阿魏酸组[40 mg/(kg·d)]、辛伐他汀组[5 mg/(kg·d)];另取6只同龄C57BL/6小鼠为空白组。高脂喂养12周后,再给药处理12周,采集小鼠粪便进行肠道菌群检测,检测血脂水平,制作肝切片观察病理变化。结果与对照组相比,模型组小鼠体重、血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)明显升高(P<0.05),肝切片可见小鼠肝细胞质内充满脂滴,大部分肝细胞呈现脂肪变性,模型组厚壁菌门(Firmicutes)和韦荣球菌科(Erysipelotrichaceae)的细菌数量升高,拟杆菌门(Bacteroidetes)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)和Odoribacter数量减少;与模型组比较,阿魏酸组小鼠体重、血清TC、TG、LDL-C显著降低,肝脂肪变性明显减轻,厚壁菌门和韦荣球菌科细菌数量减少,拟杆菌门、瘤胃菌科和Odoribacter数量升高。结论阿魏酸可以改善小鼠的血脂异常,肝脂肪变性,调节肠道菌群失衡。

基于“滞-郁-虚”动态演变探讨慢性应激诱导抑郁的病机特点

文章回溯了滞、郁、虚的概念发展源流及演变,从字形、字义角度解释滞、郁、虚的内涵,对精神疾病中定义模糊的滞、郁病机进行深层涵义的挖掘和对比研究。滞代指气机不畅、病理产物蓄积、脏腑功能失调的病机特征;郁在囊括滞的基础上强调疾病层面的忧郁病症表现,滞为郁的内在病理基础,郁为滞的外在行为表象。虚为不足,为抑郁中后阶段的主要特征。在此基础上阐述慢性应激诱导抑郁的“滞-郁-虚”病机演变特点:滞是病理基础;郁是发病机转,是抑郁行为发生的标志;虚是结局指标,是疾病加重、病程延长的病机枢纽。针对“滞-郁-虚”不同阶段,治疗当采取行气、解郁、补虚等治则,并根据具体病机、病机兼杂、病机程度而随证加减治疗。

基于NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路探讨温阳解郁方调节小鼠海马突触可塑性的机制

目的:探讨温阳解郁方改善“母婴分离+束缚应激(MS+RS)”抑郁小鼠神经炎症,保护突触可塑性的作用机制。方法:仔鼠出生第0天(PD0)随机分为空白组和造模组。造模采用母婴分离联合束缚应激21 d建立抑郁模型,PD21离乳后剔除雌鼠,随机分为模型组、温阳组、解郁组、温阳解郁组、氟西汀组,每组15只,PD21~PD111各给药组药混饲料给药,给药剂量分别为5.85、12.03、16.71 g·kg^(-1),2.6 mg·kg^(-1)。糖水偏好、开放旷场、O迷宫及新物体识别行为学实验评估小鼠焦虑抑郁和学习记忆能力;免疫组化法(IHC)观察海马小胶质细胞离子钙接头蛋白-1(Iba-1);高效液相色谱法(HPLC)检测海马去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测海马白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马NOD样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点蛋白(ASC)、胱天蛋白酶-1(Caspase-1)、IL-1β、突触素(Syn)、突触后致密物95(PSD95)蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组小鼠糖水偏好率、5 min中央运动时间、运动总距离、开臂停留时间和认知指数明显降低(P<0.05,P<0.01),IHC结果显示,小胶质细胞呈“阿米巴”激活态,Iba1明显增加,海马NE、E含量显著减少(P<0.01),IL-1β和IL-18含量显著增加(P<0.01),PSD95、Syn蛋白表达明显减少(P<0.05,P<0.01),NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白表达明显增加(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,温阳解郁组和氟西汀组小鼠糖水偏好率、认知指数增加,5 min中央运动时间、开臂停留时间、认知指数明显增加(P<0.05,P<0.01),小胶质细胞形态恢复正常,Iba1明显降低,海马NE、E含量明显增加(P<0.05,P<0.01)、IL-1β和IL-18含量显著降低(P<0.01),PSD95、Syn蛋白表达显著增加(P<0.01)、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),各中药组以温阳解郁方效果最佳。结论:温阳解郁方可能通过调节NLRP3炎症通路,缓解小胶质细胞诱导的神经炎症,增加海马神经递质含量,并改善突触可塑性,减轻MS+RS小鼠抑郁样行为,其综合效果优于温阳方和解郁方。

基于BDNF/Akt/mTOR信号通路探讨温阳解郁方调控海马神经元凋亡和突触可塑性的机制

目的:探讨温阳解郁方调节“母婴分离+束缚应激(MS+RS)”抑郁小鼠海马神经元凋亡改善突触可塑性的机制。方法:仔鼠出生第0天(PD0)随机分为空白组10只和造模组50只。造模采用MS+RS建立抑郁模型,PD21离乳后随机分为模型组、温阳组、解郁组、温阳解郁组、氟西汀组,每组10只,PD21~PD111分组给药。糖水偏好、开放旷场、O迷宫及新物体识别行为实验评估小鼠焦虑抑郁和学习记忆能力;免疫组化法(IHC)检测小鼠海马突触后致密物95(PSD95)表达情况;原位末端标记法(TUNEL)染色检测小鼠海马神经元凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马脑源性神经营养因子(BDNF)、磷酸化酪氨酸蛋白激酶/酪氨酸蛋白激酶(p-TrkB/TrkB)、磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR/mTOR)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)、突触后致密蛋白95(PSD95)、突触素(Syn)蛋白表达情况。结果:与空白组比较,模型组小鼠糖水偏好程度、中央区停留时间、运动总距离、开臂停留时间和认知指数显著减少(P<0.01),IHC结果显示海马PSD95表达明显减少,海马神经元凋亡数量增加(P<0.01),BDNF、p-TrkB/TrkB、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Bcl-2、p-mTOR/mTOR、PSD95、Syn蛋白表达显著减少(P<0.01),Bax、Caspase-3蛋白含量明显增加(P<0.05);与模型组比较,温阳解郁组和氟西汀组糖水偏好程度、5 min中央运动时间、5 min开臂停留时间和认知指数明显增加(P<0.05,P<0.01),海马PSD95表达明显增加、海马凋亡指数显著增加(P<0.01),BDNF、p-TrkB/TrkB、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、Bcl-2、PSD95、Syn蛋白含量显著增加(P<0.01),Bax、Caspase-3蛋白含量显著减少(P<0.01)。结论:温阳解郁方可以通过BDNF/Akt/mTOR信号通路,改善模型组小鼠神经元凋亡情况,保护海马突触结构和功能,缓解模型组小鼠抑郁样行为,其综合疗效及分子机制效果优于温阳方和解郁方。

二次打击致抑郁小鼠的证候属性及其机制

目的:探讨母婴分离(MS)联合慢性束缚应激(RS)致抑郁小鼠的证候属性及其机制研究。方法:仔鼠出生第0天(PD0)随机分为空白组和造模组。PD21后剔除雌鼠,随机分为模型组、温阳组、解郁组、温阳解郁组、氟西汀组,采用MS+RS建立二次打击模型,每组15只。采用糖水、悬尾及旷场实验评估小鼠焦虑抑郁样行为;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)及皮质酮(CORT)含量;高效液相-电化学法(HPLC-ECD)检测各组小鼠海马单胺类神经递质含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组小鼠海马5-羟色胺(5-HT)系统、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴及脑源性神经营养因子(BDNF)信号通路基因表达水平;免疫组化法(IHC)检测各组小鼠海马5-HT系统及HPA轴蛋白表达水平;全自动蛋白表达分析系统(Simple Wes)检测各组小鼠海马BDNF等蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠出现抑郁样行为,温阳解郁方及氟西汀可显著缓解。与空白组比较,模型组血浆CORT及ACTH含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,温阳解郁方及氟西汀组小鼠血浆CORT及ACTH含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,单胺类神经递质表达方面,模型组海马神经递质表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,温阳解郁方及氟西汀组小鼠海马神经递质表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠5-HT能神经受到抑制、HPA轴异常激活,温阳解郁方及氟西汀可调控5-HT能神经及HPA轴的异常状态。与空白组比较,海马组织BDNF、TrkB mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,温阳、解郁、温阳解郁方及氟西汀组小鼠海马BDNF、TrkB mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:二次打击致抑郁小鼠的证候属性可能是阳虚肝郁型,温阳解郁方可能通过调节5-HT神经系统及HPA轴介导的BDNF信号通路,增加海马神经递质含量,进而缓解模型小鼠抑郁样行为。

逍遥散对LPS诱导神经炎症小鼠的作用机制

目的观察LPS诱导小鼠海马小胶质细胞激活和炎症因子、炎症介质的含量,探讨逍遥散对海马神经炎症的作用机制。方法75只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组(NC)、模型组(LPS)、逍遥散组(XYS)、氟西汀组(FIU)和阿司匹林组(ASP)。各组给予相应饲料饲养7天后腹腔注射1 mg·kg^(-1)的LPS溶液造模,观察各组小鼠一般情况;旷场、O迷宫实验评估小鼠行为情况;酶联免疫吸附剂测定(Elisa)法检测海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS的含量;免疫组化法(IHC)观察海马小胶质细胞及离子钙接头蛋白-1(Iba-1)的表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测核因子-κB(NF-κB)、toll样受体4(TLR4)、c-Jun氨基末端激酶3(JNK3)、细胞外调节蛋白激酶1(ERK1)、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(Raf-1)、酪氨酸蛋白激酶(PTK)mRNA的表达水平。结果与NC比较,LPS组小鼠扎堆蜷缩,毛发稀疏无光泽,便溏,眼周有白色分泌物;旷场、O迷宫实验中周围区运动距离、中央区运动距离,开放臂运动距离、闭合臂运动距离及运动总距离显著下降(P<0.01)。海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS含量显著升高(P<0.05或P<0.01);IHC结果显示小胶质细胞过度激活,Iba-1在海马CA1和CA3区的表达显著增加(P<0.01);NF-κB、TLR4、JNK3、ERK1、raf-1、PTK mRNA的表达上升(P<0.05或P<0.01)。与LPS组比,各给药组小鼠活动减少;XYS、ASP组中央区运动距离显著上升(P<0.05或P<0.01),FLU组周围区、中央区运动距离和运动总距离显著上升(P<0.01或P<0.05);各给药组闭合臂运动距离和运动总距离显著升高(P<0.05或P<0.01);各给药组小鼠海马小胶质细胞活化减少,XYS组Iba-1表达下降显著(P<0.01)。XYS、FLU组JNK3、NF-κB、TLR4显著下降(P<0.05或P<0.01);ASP组raf-1、ERK1、TLR4显著下降(P<0.05或P<0.01)。结论逍遥散的综合疗效及药理作用优于氟西汀和阿司匹林,其作用机制可能通过抑制LPS诱导小鼠海马区小胶质细胞的激活,降低IL-1β,IL-6,TNF-α,iNOS的含量,下调NF-κB、TLR4、JNK3、PTK mRNA的表达,从而改善LPS诱导小鼠海马神经炎症及异常行为。

母婴分离/束缚应激模型小鼠海马小胶质细胞变化及温阳解郁方的调节作用

目的:观察母婴分离/束缚应激诱发焦虑抑郁小鼠海马小胶质细胞激活和白细胞介素-1β(IL^(-1)β),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达情况,探讨温阳解郁方抗焦虑抑郁的机制。方法:84只雄性C57BL仔鼠于出生后第0天(PD0)随机分为空白组、束缚应激组和造模组,造模组采取母婴分离结合束缚应激制备焦虑抑郁模型,将造模组按随机数字表法分为模型组、温阳组、解郁组、温阳解郁组和氟西汀组。在离乳第21天(PD21)至成年第90天(PD90),空白组、束缚应激组和模型组饲喂正常饲料,其余饲喂药混饲料(温阳组、解郁组、温阳解郁组和氟西汀组用药剂量分别为5.85,12.03,16.71 g·kg^(-1)及2.60 mg·kg^(-1))。采用旷场实验,O迷宫和社会交互实验评估模型组小鼠焦虑抑郁状态;免疫组化法(IHC)观察海马小胶质细胞及离子钙接头蛋白-1(Iba-1)表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测IL^(-1)β,IL-6,TNF-α,Iba-1,糖皮质激素受体(GR)mRNA表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠5 min运动总路程和中央区活动时间显著减少(P<0.01),开臂活动时间与活动总路程明显减少(P<0.05,P<0.01),训练探察时间和辨别探查时间显著增加(P<0.01),Iba-1蛋白及mRNA表达,IL^(-1)β,IL-6,TNF-αmRNA表达水平显著升高(P<0.01),GR mRNA表达水平显著降低(P<0.01),IHC结果显示小胶质细胞的过度激活。与模型组比较,温阳解郁方及氟西汀组小鼠5 min运动总路程和中央区活动时间显著上升(P<0.01),开臂活动时间显著上升(P<0.01),训练探察时间和辨别探查时间明显降低(P<0.05,P<0.01);Iba-1蛋白及mRNA表达,IL^(-1)β,IL-6,TNF-αmRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),GR mRNA表达水平显著上升(P<0.01),IHC结果表明小胶质细胞的形态恢复;温阳组和解郁组小鼠开臂活动时间显著上升(P<0.01),辨别探查时间明显降低(P<0.05),Iba-1蛋白及mRNA表达,IL-6 mRNA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);温阳组小鼠GR mRNA表达水平明显上升(P<0.05),TNF-αmRNA表达水平明显降低(P<0.05);解郁组小鼠5 min运动总路程显著上升(P<0.01),训练探察时间明显降低(P<0.05),IL^(-1)βmRNA表达水平明显降低(P<0.05),IHC结果表明两组小胶质细胞有所恢复。结论:温阳解郁方的综合疗效和药理作用优于温阳方和解郁方,其作用机制可能通过抑制母婴分离/束缚应激小鼠海马小胶质细胞的激活,降低IL^(-1)β,IL-6,TNF-α等细胞因子的表达,增加海马GR表达,从而改善小鼠的焦虑抑郁样行为。

基于网络药理学和实验验证探讨二仙汤及其温肾拆方治疗抑郁症的可行性

目的:基于网络药理学技术预测二仙汤全方和温肾方治疗抑郁症的分子机制,通过母婴分离结合慢性束缚应激抑郁模型进行药效及机制对比,探讨温肾拆方治疗抑郁症的可行性。方法:通过中药系统药理学数据平台(TCMSP)和中药分子机制生物信息学数据库(BATMAN)收集二仙汤全方及温肾方的活性成分及作用靶点;利用人类基因数据库(Genecards)、在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)、药物银行(Drugbank)等数据库筛选抑郁症相关靶点,与药物靶点取交集获得药物-疾病共同靶点,随后导入Cytoscape 3.8.2软件绘制中药-活性成分-靶点-疾病网络图;利用STRING平台构建蛋白互相作用网络并筛选核心靶点及关联的核心成分;采用Metascape平台对交集靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能富集分析。采用母婴分离结合慢性束缚应激制备抑郁小鼠模型,在离乳第21天(PD21)至束缚完成第111天(PD111)给予二仙汤全方和温肾方的药混饲料进行干预。根据糖水偏好实验、悬尾实验、旷场实验、高架O迷宫实验评估小鼠抑郁状态;免疫组织化学法(IHC)观察小胶质细胞离子钙接头蛋白-1(Iba-1)表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测蛋白激酶B1(Akt1)、脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密物95(PSD95)、突触素(Syn)等表达水平。结果:共筛选二仙汤全方和温肾方治疗抑郁症靶点126和118个,全方仅多8个靶点。两方核心靶点相同,主要包括Akt1、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、KEGG通路富集分析预测二仙汤全方和温肾方治疗抑郁症主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路及神经活性配体-受体相互作用通路。动物实验表明,与抑郁症模型组比较,二仙汤全方和温肾方均可明显上调小鼠糖水偏好指数、中央区活动时间及穿越次数、开放臂停留时间及穿越次数、p-Akt1、BDNF、PSD95及Syn的表达水平(P<0.05,P<0.01),明显下调悬尾不动时间和海马小胶质细胞Iba-1表达水平(P<0.05,P<0.01),两方疗效差异无统计学意义。结论:以肾阳虚为主的抑郁症病机和证候规律下,二仙汤的温肾拆方治疗具有可行性。其机制可能与两方均可通过影响Akt1、IL-1β、IL-6、TNF-α等核心靶点及调控PI3K/Akt、MAPK及神经活性配体-受体相互作用信号通路,改善海马区神经炎症及突触可塑性有关。

基于网络药理学和实验验证的二仙汤调治焦虑障碍的分子机制

目的:基于网络药理学方法预测二仙汤治疗焦虑障碍的潜在分子机制,并借助母婴分离结合束缚应激动物模型进行疗效及机制验证。方法:利用中医药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)和成分靶点预测数据库(SwissTargetPrediction)获取二仙汤的活性成分及作用靶点;通过基因数据库(GeneCards)、疗效药靶数据库(TTD)、在线人类孟德尔遗传病数据库(OMIM)和药物数据库(DrugBank)等获取焦虑障碍相关靶点,与药物靶点取交集获得药物-疾病交集靶点;利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图,并基于拓扑参数分析筛选核心靶点;通过Metascape平台对交集靶点进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。采用母婴分离结合束缚应激建立焦虑小鼠模型,在第21天(PD21)离乳至第97天(PD97)束缚完成期间给予二仙汤药混饲料干预。通过开放旷场实验、高架O迷宫实验评估小鼠焦虑状态。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测小鼠血浆皮质酮(CORT)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠海马蛋白激酶B(Akt1)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、脑源性神经营养因子(BDNF)、突触后致密物-95(PSD95)及突触素(synaptophysin)的表达水平。结果:共获得二仙汤活性成分97种,作用靶点227个,焦虑障碍相关靶点3863个,药物-疾病交集靶点161个,其中Akt1、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、mTOR等核心靶点可能与焦虑障碍密切相关。KEGG通路分析结果显示二仙汤治疗焦虑障碍主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及神经活性配体-受体相互作用等信号通路。动物实验结果显示,与模型组比较,二仙汤可显著增加小鼠中央区活动时间及穿越次数、开放臂停留时间及穿越次数、明显上调p-Akt1、p-mTOR、BDNF、PSD95、Syp的表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:二仙汤调治焦虑障碍具有多靶点-多通路的作用特点,其机制可能与二仙汤通过影响Akt1、mTOR、IL-1β、IL-6、TNF等核心靶点及调控PI3K/Akt、MAPK及神经活性配体-受体相互作用等信号通路,改善神经炎症与突触可塑性有关。

温阳、解郁及温阳解郁方对LPS“二次应激”诱发的抑郁样行为小鼠海马小胶质细胞的影响

目的:观察母婴分离(MS)联合脂多糖(LPS)应激后抑郁样行为小鼠海马区小胶质细胞活化及炎症因子的表达情况,从温阳、解郁及温阳解郁二方合用的角度探讨温阳解郁法抗抑郁的可能机制。方法:将70只仔鼠随机分为正常组(10只)、LPS应激组(LPS,10只)和造模组(MS,50只),造模组小鼠在产后第5天(PD5)-PD14进行8 h·d^(-1)的母婴分离,后将造模组分为母婴分离+脂多糖应激组(MS+LPS),温阳组(WY),解郁组(JY),温阳解郁组(WYJY)及氟西汀组(FLU),每组10只。将仔鼠出生日期记为PD0,正常,LPS及MS+LPS组小鼠于PD21-PD90饲喂正常饲料,其余各组给予对应的药混饲料喂养,且于PD91给予脂多糖腹腔注射7 d,建立抑郁症小鼠模型。采用旷场,O迷宫和社会交互实验检测各组小鼠抑郁样行为;免疫组化法观察海马组织小胶质细胞钙结合蛋白-1(Iba-1)蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α),Iba-1及糖皮质激素受体(GR)mRNA表达量。结果:与正常组比较,LPS组小鼠5 min中心区停留时间有减少趋势、运动总路程显著减少(P<0.01),活动总路程显著减少(P<0.01),MS+LPS组小鼠开放臂活动时间及活动总路程明显减少(P<0.05,P<0.01),训练、辨别探查时间显著升高(P<0.01),LPS,MS+LPS组小鼠海马CA1区Iba-1表达显著升高(P<0.01);与LPS组比较,MS+LPS组小鼠5 min运动总路程明显增长(P<0.05),训练、辨别探查时间明显升高(P<0.05,P<0.01),海马CA1区Iba-1表达显著升高(P<0.01);与MS+LPS组比较,各给药组小鼠5 min运动总路程均明显减少(P<0.01),训练探查时间均显著降低(P<0.05,P<0.01),JY,WYJY,FLU组小鼠辨别探查时间均显著降低(P<0.01),各给药组小鼠海马CA1区Iba-1表达显著降低(P<0.01)。结论:温阳解郁法可能通过抑制抑郁症小鼠海马区小胶质细胞的激活,降低IL-1β,IL-6,TNF-α等炎症因子的表达,进而抑制抑郁症发生及发展。

温阳、解郁及温阳解郁方对母婴分离结合慢性神经疼痛应激小鼠疼痛敏感性及抑郁样行为的调节作用

目的:观察母婴分离小鼠给予慢性神经疼痛应激后的行为、痛阈改变,以及血清和中枢抑郁、疼痛相关指标的变化,以温阳方、解郁方、及温阳解郁方进行干预探讨温阳解郁法抗抑郁、改善疼痛敏感的可能机制。方法:以小鼠出生日为PD0,小鼠在出生后随机分为对空白组和母婴分离组,母婴分离组在PD5~14进行8 h·d;的母婴分离,离乳后将其分为母婴分离组、温阳组、解郁组、温阳解郁组和氟西汀组,每组15只,同时以15只未经母婴分离的同期雄性仔鼠作为空白组。空白组、母婴分离组小鼠于PD21~90以普通发育饲料喂养,余组分别以温阳方二仙汤、解郁方逍遥散、温阳解郁方及氟西汀药混饲料喂养(用药剂量分别为5.84、12.00、16.68 g·kg;及2.60 mg·kg;)。于PD91行坐骨神经结扎手术,建立母婴分离+慢性神经病理性疼痛模型。采用旷场实验观察各组小鼠抑郁样行为,测量机械痛阈和温度痛阈检测各组小鼠疼痛敏感性,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清皮质酮(CORT)、P物质及β-内啡肽(β-EP)含量,免疫组化检测杏仁核糖皮质激素受体(GR)和下丘脑β-EP蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测杏仁核糖皮质激素受体基因(Nr3c1)、FK506结合蛋白5基因(FKBP5)、代谢型谷氨酸受体5基因(GRM5)及脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达量。结果:与空白组比较,母婴分离组小鼠5 min旷场中心停留时间和运动总距离均显著减少(P<0.01),机械痛阈显著降低(P<0.01)。血清CORT和β-EP均显著上升(P<0.01),FKBP5 mRNA表达显著下降(P<0.01)。下丘脑β-EP表达上升,差异具有明显统计学意义(P<0.05)。与母婴分离组比较,各给药组5 min旷场中心停留时间均明显增加(P<0.05,P<0.01),温阳组、温阳解郁组和氟西汀组小鼠在5 min旷场运动总距离明显增加(P<0.05,P<0.01),各给药组痛阈均不同程度上调。解郁组小鼠血清CORT显著下降(P<0.01),β-EP明显下降,但差异无统计学意义;BDNF mRNA显著上升(P<0.01)。温阳组小鼠Nr3c1及GRM5 mRNA均明显下降(P<0.05,P<0.01)。温阳解郁组小鼠血清CORT明显下降(P<0.05),Nr3c1、GRM5及BDNF mRNA均下降(P<0.05,P<0.01),差异具有明显统计学意义,各给药组下丘脑β-EP表达水平均有不同程度提升,但差异无统计学意义。温阳组、解郁组和温阳解郁组小鼠杏仁核GR表达水平均明显上升,差异具有明显统计学意义(P<0.05)。结论:温阳解郁方可通过增强杏仁核GR表达、抑制杏仁核区神经可塑性及兴奋性达到抑制中枢疼痛敏化和调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能,缓解抑郁行为和改善躯体疼痛过敏的作用。