球形与螺旋形幽门螺杆菌基因表达差异的研究

目的 :从基因转录水平了解球形幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)基因表达的变化。 方法 :幽门螺杆菌标准株NCTC 116 37和 2株临床分离株 ,经抗生素—灭滴灵诱导球变。提取等菌量螺旋形和球形Hp的RNA ,RT PCR扩增Hp 2 5种基因 ,这些基因包括毒力基因 (kat、aphA、rdxA、frxA、cysS、ureB、glmM、cagA、vacA、fldA、iceA1、hpaA、fliD、napA、oipA、alpAB、babB、hopZ) ;看家基因 (scoB、atpD、glnA、recA)和功能不明的外膜蛋白基因 (hopW、hopX)。扩增产物经分子定量成像系统进行扫描定量。 结果和结论 :等菌量的球形HpRNA量比螺旋形Hp减少。NCTC 116 37、F4 4和F4 9菌株的螺旋菌分别有 2 5、2 0、19个基因RT PCR阳性 ,对应的球形菌相应的基因RT PCR也为阳性。定量分析结果表明 :被检测的基因在球形菌中的表达均比螺旋菌降低。提示球形菌致病性的降低与基因的低表达有关。 3株球形菌不同基因表达的变化并不完全一致 ,表达量变化较小且各菌间较一致的是glmM、oipA、glnA ;表达量变化较大且菌间较一致的基因是 :napA、sodB、recA、fliD。

球形幽门螺杆菌致小鼠感染

目的 证明球形幽门螺杆菌体内致病性。方法 用抗生素和水诱导幽门螺杆菌 (Hp)球变 ,螺旋形和球形Hp分别经胃灌注接种BALB/c小鼠 ,实验组小鼠 (各 16只 )接种Hp菌液 0 .4ml/只 ( 10 9/ml) ,接种 4次 ,2w完成 ,对照组 ( 10只 )接种生理盐水。距最后一次接种后 3和 4w分别处死小鼠各半。取胃粘膜组织作细菌学检测 (包括胃粘膜快速尿素酶试验 ,细菌培养鉴定 ,电镜观察 )和组织学检测。结果 螺旋菌、抗生素诱变的球形菌、水中球形Hp这 3个实验组的胃粘膜组织快速尿素酶试验阳性率分别为 93 .8% ( 15 /16)、87.5 % ( 14 /16)、5 0 % ( 8/16) ,由此反映的细菌定居量评分为 1.75、1 13、0 .5 6,细菌培养阳性率分别为 87.5 % ( 14 /16)、75 .0 % ( 12 /16)、68.8% ( 11/16) ,对照组阴性。Hp感染 3w和 4w的实验结果无差异。电镜下可见 3个实验组均有弯曲形、杆状和球形Hp粘附于胃粘膜上。组织学检测发现感染的小鼠胃粘膜呈正常、轻度或重度糜烂、溃疡等不同的表现 ,有炎症细胞浸润。水中球形Hp感染引起的胃粘膜损伤较轻。 结论 球形Hp可致胃炎或溃疡。

球形幽门螺杆菌致细胞空泡变性毒力研究

目的指示球形幽门螺杆菌致细胞空泡变性毒力的变异情况。方法采用延期培养和加亚抑菌浓度抗生素，对细胞毒相关蛋白基因阳性（cagA＋），和细胞空泡毒素基因阳性（vacA＋）的高毒株幽门螺杆菌（Hp）进行球形诱变，进而检测该Hp至Hela细胞空泡变性的毒力，并用SDS-PAGE、PCR及PCR-SSCP技术，分析球形Hp蛋白产物及决定细胞空泡变性的cagA和vacA基因的变异情况。结果与结论球形Hp致细胞空泡毒力减弱，74KD以上的蛋白含量减少，特别是125KD条带尤为明显。259bp的vacA基因片段和349bpcagA基因片段未发生缺失，但两种方法诱变的球形HpvacA基因均存在点突变。

球形幽门螺杆菌分子生物学研究

为研究幽门螺杆菌（ＨＰ）球形变异本质，作者通过延期培养和采用亚抑菌浓度抗生素，使３株ＨＰ发生球形变异，对弯曲形和球形ＨＰ作了ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹及４个毒力基因片段ＰＣＲ和ＰＣＲ－ＳＳＣＰ分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱显示球形ＨＰ分子量在７４×１０４以上的蛋白含量减少，免疫印迹显示球形ＨＰ１２５×１０４蛋白条带反应减弱，而抗生素诱变的球形ＨＰ分子量为１１×１０４和６３×１０４的蛋白条带反应增强。ＰＣＲ及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ结果表明球形ＨＰ的ｈｐａＡ，ＶａｃＡ，ＣａｇＡ和ＵｒｅＡ４个毒力基因片段未发生缺失。

幽门螺杆菌oipA基因片段的克隆表达及抗原性分析

目的:分片段克隆表达幽门螺杆菌oipA基因,确定抗原性最强的重组蛋白肽段。方法:从Hp国际标准株NCTC11637中获取oipA全长基因,克隆至pGEM-T载体并鉴定正确,以重组pGEM-T/oipA为模板PCR扩增6个不同大小的oipA基因片段,与表达载体pET-42a连接,转化大肠杆菌BL-21,重组子经PCR、酶切、测序鉴定。IPTG诱导重组蛋白肽段的表达,经Western Breeze化学发光法鉴定融合蛋白;优化诱导时间和IPTG浓度,诱导重组蛋白大量表达;Ni-NTA His·Bind树脂亲和纯化表达产物;羊抗Hp多克隆抗体,Western blot法检测纯化蛋白的抗原性,间接ELISA法筛选抗原性最强的重组肽段。结果:6条oipA基因片段在大肠杆菌中都得到了表达,表达的蛋白肽段均可被抗Hp多克隆抗体识别,具有抗原性,其中反应性最强的是最小的蛋白肽段。结论:oipA基因片段可在原核系统中表达,所获取的最小的肽段抗原性最强,可望制备检测血清相应抗体的试剂盒。

幽门螺杆菌cagA基因稳定转染胃上皮细胞及其对细胞的作用

目的研究幽门螺杆菌(Hp)cagA基因重组子转染胃上皮细胞后对胃上皮细胞的作用。方法用PCR方法从Hp标准株NCTC11637中获取cagA全长基因,将其3.4kb的开放读码框架定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1;获得的重组子转染SGC-7901细胞,筛选耐潮霉素的细胞克隆,用RT-PCR方法检测细胞内cagA基因在转录水平的表达;用荧光染色技术、MTT、流式细胞术检测CagA对细胞表型、增殖、凋亡及细胞周期的影响。结果CagA阳性表达的细胞(ScagA)体积变大、胞浆出现空泡样变、胞膜出芽、细胞皱缩;用MTT法检测细胞增殖:ScagA细胞较SpcDNA3.1细胞(pcDNA3.1转染的细胞)生长增殖明显缓慢(P=0.009),表明ScagA细胞生长受抑制;流式细胞检测细胞凋亡结果:ScagA的凋亡率显著高于SpcD-NA3.1(P值:0.02);细胞周期分析显示:ScagA细胞有S期比率增高、G2-M、G0-G1期比率下降的趋势。结论cagA开放读码框架在培养细胞内的表达可引起细胞表型转变、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。

两种念珠菌DNA探针的研制及应用

目的制备两种念珠菌ＤＮＡ探针并应用于临床诊断。方法对聚合酶链反应扩增的白色念珠菌标准株的Ｅ０３基因的１２５ ｂｐ片段，用半抗原地高辛标记；合成仪合成的 Ｅ０３基因中 ２５ｂｐ特异寡核苷酸，用生物素标记。检测两种探针显色敏感度，并与２３株临床分离的白色念珠菌、热带念珠菌，近平滑念珠菌、克柔念珠菌星形念珠菌及大肠埃希菌等细菌进行斑点杂交试验。结果Ｄｉｇ－１２５ ｂｐＤＮＡ探针显色敏感度为 ０．０１ｐｇ，仅与白色念珠菌杂交，且对临床分离株检测的结果与传统厚膜孢子鉴定法相符。 Ｂｉｏ－２５ｂｐＤＮＡ探针显色敏感度为 ２０ｐｇ，与白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌及星形念珠菌杂交。结论 Ｂｉｏ－２５ｂｐＤＮＡ 探针可用于念珠菌初步鉴定，而Ｄｉｇ－１２５ｂｐＤＮＡ探针可用于白色念珠菌的鉴定。

快速高效提取白色念珠菌DNA

目的建立两种简便的白色念珠菌ＤＮＡ提取方法，即纯ＤＮＡ提取法和快速ＤＮＡ提取法。方法以原生质体提取法为基础进行改良，两种方法均用Ｌｙｔｉｃａｓｅ破壁。结果与结论纯ＮＤＡ提取法提取ＤＮＡ耗时６～７ｈ，产量较高，每１０^（１０）个菌细胞可提取４μｇＤＮＡ，且纯度高，ＯＤ_（２６０）ＯＤ_（２８０）＞１．７，对核酸限制性内切酶敏感，适用于各种分子生物学方面的研究。快速ＤＮＡ提取法全过程仅需３～４ｈ，每１０^（１０）个菌细胞提取１μｇＤＮＡ，ＯＤ_（２６０）：ＯＤ_（２８０）＝１．４，不能进行核酸限制性内切酶酶切，但可用于作ＰＣＲ扩增。

素质教育与21世纪医学人才培养

知识经济时代迫切需要高素质的医学人才，素质教育成为新医学教百模式的核心，它包括人文素质教育和专业创新教育。医学人才人文教育的重要内容是医德品质教育。其目的是造就具有优良医德品质的医学人才。专业创新教育是素质教育的精髓，其目的是赋予医学人才以广博的知识和技能，并使其具有较强的能力，包括获取新知识，解决问题和实践能力，从而造就具有创新能力的医学人才。

幽门螺杆菌耐药性测定及其机制的初步探讨

用7种抗生素对44株临床分离的幽门螺杆菌(H.p)进行耐药性研究,并时其中19株H.p进行质粒检测,发现H.p对氨苄青霉素及痢特灵敏感,对庆大、氟哌酸等5种抗生素出现不同程度耐药现象。质粒检出率为31.6％,质粒与本试验所用抗菌素耐药性无关。研究还发现亚抑菌浓度抗生素可引起H.p发生球形变,本文对H.p的球形变现象及其与耐药性关系进行探讨。

幽门弯曲菌S_1型VacA基因的检测及其意义

目的研究幽门弯曲菌（Ｈｐ）Ｓ１型ＶａｃＡ基因与胃十二指肠疾病的关系。方法用ＰＣＲ技术检测６０株Ｈｐ的Ｓ１型ＶａｃＡ基因。６０株Ｈｐ分别分离自８例胃癌、１９例消化性溃疡和３３例慢性胃炎患者。结果７例胃癌、１５例消化性溃疡和３例慢性胃炎患者的Ｈｐ检出Ｓ１型ＶａｃＡ基因，检出率分别为８７．５％，７８．９％和９．１％。结论感染含Ｓ１型ＶａｃＡ基因的Ｈｐ与消化性溃疡的发生有密切的关系，可能与胃癌的发生有关。

小肠结肠炎耶氏菌毒力相关基因探针的制备

本研究采用分子生物学方法从0:8型小肠结肠炎耶氏菌(Ye菌)所携带的毒力大质粒上分离、纯化了与Sereny试验相关的毒力基因2.8kb片段,经半抗原标记作为探针。菌落原位杂交结果证明2.8kb探针可与含表达VW抗原质粒的不同型Ye菌和假结核杆菌特异性杂交,与宋氏痢疾、EIEC和大肠杆菌无交叉反应。表明2.8kb探针有高度的特异性,且它与痢疾杆菌和EIEC的Sereny反应无关。

球形幽门螺杆菌体外细胞粘附性研究球形Hp系列研究之一

通过采用延长培养时间和亚抑菌浓度抗生素的作用，使幽门螺杆菌（Ｈｐ）发生球形变异。电镜下观察球形Ｈｐ结构，并对球形Ｈｐ进行尿素酶活性测定和Ｈｅｐ－２细胞粘附试验，电镜下计算粘附率、粘附指数、侵袭率、侵袭指数。结果表明球形Ｈｐ具有完整的细胞壁，它不是Ｌ型细菌，尿素酶活性降低或消失，细胞粘附能力减弱，侵袭力与正常Ｈｐ无差异。以上两种方法诱变产生的球形Ｈｐ对细胞的粘附能力无差异。

球形幽门螺杆菌生物学性状及蛋白产物研究球形Hp系列研究之二

目的：研究球形幽门螺杆菌生物学性状和蛋白产物发生的改变。方法：通过延长培养时间和亚抑菌浓度抗生素－－灭滴灵的作用，分别获得两类球形幽门螺杆菌（Ｈｐ）。结果：两种不利于Ｈｐ生长的环境在引起Ｈｐ发生球变的同时，每毫升菌落形成单位（ＣＦＵ／ｍｌ）减少，尿素酶活性降低。结论：球形Ｈｐ尿素酶活性低下，且在常规培养基上不能生长。抗生素的作用比延期培养更快使Ｈｐ发生球形变异。聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质条带分析发现抗生素诱变的球形Ｈｐ与正常形态Ｈｐ基本相似，与延期培养的Ｈｐ明显不同。

略论硕士研究生免疫学教学方法

免疫学内容素以深奥、抽象、记忆量大而使学生倍感困惑，作者根据多年的教学实践提出必须注重创造性思维的启发、相关内容的序贯组合、直观教具的引入、基础理论与新进展的结合、理论和科研实验的结合。方能使讲课具有一定的深度和广度，获得预期的教学效果。

幽门螺杆菌膜分离组分对SGC-7901细胞的促增殖作用

目的探寻幽门螺杆菌(Hp)促细胞增殖组分。方法利用超声破碎法提取NCTC11637Hp不同组分,获得分泌成分、菌膜及胞浆内容,分别加入SGC-7901细胞,共育24h,用MTT法检测各组分对细胞增殖的影响。进而用细菌蛋白提取试剂盒(P-PEK)分离菌膜蛋白,获得4个不同溶解度膜蛋白组分,分别或两两组合后加入SGC-7901细胞,用MTT法和Ki-67细胞免疫组化检测细胞增殖情况。结果低浓度Hp菌膜(≤1μg/mL)可促细胞增殖,增殖率可达119.32%(P<0.05);Hp菌膜3个不同溶解度膜蛋白组分单独作用于细胞时抑制细胞增殖,但低浓度的"中溶解度"和"难溶解度"混合组分促细胞增殖,增殖率可达115.55%(P<0.05)。结论Hp促细胞增殖成分存在于菌膜的"中溶解度"和"难溶解度"混合组分中。

应用DNA探针鉴定临床分离的念珠菌

〔目的〕制备念株菌DNA探针并应用于临床诊断。〔方法〕应用聚合酶链反应扩增白念珠菌标准株的EO3 基因 12 5bp片段 ,同时合成EO3 的 2 5bp特异寡核苷酸 ,扩增产物用半抗原地高辛标记 ,合成寡核苷酸用生物素标记制备成探针 ,检测两种探针显色敏感度 ,并与 2 3株临床分离的白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌及大肠杆菌等细菌进行斑点杂交试验。〔结果〕Dig- 12 5bpDNA探针显色敏感度为 0 .0 1pg,仅与白念珠菌杂交 ;Bio - / 2 5bpDNA探针显色敏感度为2 0pg ,与白念珠菌、热带念珠菌及近平滑念珠菌杂交。〔结论〕Dig- / 2 5bpDNA探针 ,可用于白念珠菌鉴定 ;Bio - 2 5bpDNA探针 ,可用于念珠菌初步鉴定。

肠球菌溶血素与其致病力的关系

目的 探讨肠球菌溶血素的毒力因子作用。方法 分别检测 3 9株临床标本分离的粪肠球菌以及 3 1株健康人群粪便分离的粪肠球菌的溶血素检出率 ;并检测了β溶血肠球菌、非 β溶血肠球菌对 9种抗生素的敏感性。 结果 临床菌株的溶血素检出率为 5 8.9% ,健康人群分离株的溶血素检出率为 19.3 % (P <0 .0 0 5 ) ;β溶血株对抗生素的耐药性明显高于非 β溶血株 (P <0 .0 1)。