斯里兰卡木薯花叶病毒TVM3分离物侵染性克隆构建及鉴定

【目的】斯里兰卡木薯花叶病毒(Sri Lankan cassava mosaic virus,SLCMV)是一种对世界木薯产业产生威胁的单链环状DNA病毒,为双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)成员。我国木薯品种抗性不明且抗病种质资源缺乏,为进一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景以及SLCMV与宿主的互作机理,本研究开展SLCMV侵染性克隆构建及鉴定。【方法】以SLCMV(TVM3株系)为对象,将其1.10倍(mer)长的DNA-A和1.08倍(mer)的DNA-B组分分别构建到pCAMBIA1301载体,获得病毒侵染性克隆载体pCAMBIA1301-DNA-A(pDNA-A)和pCAMBIA1301-DNA-B(pDNA-B),利用GV3101农杆菌介导pDNA-A和pDNA-B共侵染本生烟和拟南芥。【结果】SLCMV侵染性克隆接种本生烟14 d后,系统叶可产生严重的花叶、扭曲等症状;而感染SLCMV的拟南芥叶片在18 d出现轻微的扭曲症状。提取感病本生烟和拟南芥植株新生叶片总DNA,PCR方法均检测到了病毒DNA-A和DNA-B组分。此外,本生烟的病毒感染率为100%,而拟南芥的病毒感染率仅为40%,两者差异显著(P<0.05)。【结论】本研究成功构建了SLCMV病毒侵染性克隆,且能侵染本生烟和拟南芥植物,其在本生烟中的病毒感染率高达96.67%;另外,该pDNA-A和pDNA-B侵染性克隆载体序列仅为病毒原基因组DNA-A和DNA-B大小的1.10倍(mer)和1.08倍(mer),且不含有重复的编码区序列,可为下一步探究国内木薯种质资源抗花叶病的遗传背景以及病毒致病机理研究提供重要基础。

肯尼亚科学家通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得抗香蕉条斑病毒的香蕉品系

香蕉(Musa spp.)是世界上重要的经济作物之一,广泛种植于世界各地的热带和亚热带地区。香蕉条斑病毒(Banana streak virus, BSV)是侵染香蕉的重要病原物之一,是副反转录病毒(Pararetrovirus),属花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)杆状DNA病毒属(Badnavirus)。

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

[目的]对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation pro-teins,Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。[方法]以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。[结果]应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b-Rep。将重组质粒转化E.coliBL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12%SDS-PAGE电泳分析,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。[结论]利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。

香蕉束顶病毒海口分离物CP基因的原核表达、纯化及其抗血清制备

用PCR方法从感染香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增外壳蛋白(coat protein,CP)基因。回收目的片段,经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的质粒载体pET30a(+)相连接,酶切验证及测序结果获得了含BBTV CP基因的重组质粒pET30a-CP。将重组质粒转化Codon plus表达菌,在25℃、0.4mmol/L IPTG条件下诱导6h或过夜,经12%SDS-PAGE电泳分析可知,该重组菌表达了一个与预期分子量大小一致的His-CP融合蛋白,约为30ku,且主要以包涵体的形式存在。多次洗涤包涵体后得到高纯度的融合蛋白,用其免疫家兔,获得BBTV CP蛋白抗血清。间接ELISA法测定抗血清效价大于51200。Western blot分析表明,抗血清能与融合蛋白特异性结合。

香蕉束顶病毒海口分离物核穿梭蛋白(NSP)的纯化及抗血清制备

本研究以本实验室保存的含重组载体pDEST17-NSP的原核表达菌株E.coli BL21(DE3)为材料,于25℃、0.1mmol/L IPTG条件下诱导4h,集菌后超声波破碎,获得以包涵体形式表达的约20kD的融合蛋白。实验结果表明,将沉淀的融合蛋白溶于含6mol/L尿素的Binding Buffer中,再经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,可获得高纯度的融合蛋白。将纯化融合蛋白经12%SDS-PAGE电泳,切胶回收目的带,液氮研磨并按1:1(W/V)混合佐剂,4次免疫家兔,获得BBTV病毒核穿梭蛋白的特异性抗血清。以融合蛋白作抗原,间接ELISA法测定其抗血清效价为1:5000。田间检测样品的最佳抗血清工作浓度为1:500。Western Blot鉴定结果表明抗血清能与目的蛋白特异性结合。本研究的结果将为下一步NSP基因转录调控和蛋白功能研究奠定一定基础。

海南岛巴西橡胶和香蕉cat相关基因的克隆及分析

根据GenBank上已有的植物cat基因序列,设计一对兼并引物。在海南岛采集香蕉、巴西橡胶、黄灯笼辣椒、菠萝、甘蔗、番木瓜等作物的叶片并提取总RNA,反转录成cDNA,PCR进行同源克隆。结果获得了巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因,而未获得其它4种作物cat相关基因。序列分析发现,巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因开放阅读框(ORF)都为1 479 bp,编码492个氨基酸,GenBank登陆号分别为HQ660587和HQ660588。生物信息学软件分析巴西橡胶CAT-1和香蕉CAT-2蛋白的三级结构分别与Exiguobacteriu Oxidotolerans(PDB code:2j2mA0)和Pseudomonas Syringae(PDB code:1m7sA)相似。构建系统发育树表明巴西橡胶CAT-1与蓖麻CAT-1氨基酸序列(Ricinus communis:XP_002521709.1)同源性最高,为92.1%;香蕉CAT-2与油棕CAT-2氨基酸序列(Elaeisguineensis:ACF06566.1)同源性最高,达90.9%。

仙人掌总RNA提取方法的改进与分析

利用亚硫酸钠分别与TRIzol试剂、RNA plant plus Reagent试剂、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂、艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂和OMEGA Plant RNA试剂结合的方法,均可获得高质量的仙人掌茎总RNA。反转录成cDNA,RT-PCR结果显示,5种方法提取的总RNA反转录后均能特异性扩增到matK基因。使用TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒和艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA质量相对较高,在cDNA以1∶100稀释时能检测到matK基因;而使用BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒或OMEGA Plant RNA试剂盒时,灵敏度稍低,在cDNA以1∶10稀释时,能检测到目的基因。利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行比较研究,为后续制备仙人掌茎高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。

香蕉束顶病毒Rep蛋白特性分析及纯化体系的建立

以香蕉束顶病毒海口分离物DNA1(Accession NO.FJ463042)的Rep蛋白为研究对象,利用生物信息学软件对该蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、磷酸化、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测,并配置了相关纯化试剂。将含重组质粒pET32b-Rep的E.coli BL21(DE3),接种到LB液体培养基,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4 h,产生大量的可溶性重组蛋白,经AKTA Explorer100系统亲和层析柱后,用不同梯度的Washing buffer洗脱杂蛋白并对各阶段产物进行12%SDS-PAGE分析,确定了100mmol/L咪唑的Washing buffer洗脱浓度,最终获得大量高纯度的重组蛋白。以His*Tag Monoclonal Antibody为一抗,Western blot鉴定结果表明纯化重组蛋白即为His-Rep融合蛋白。该纯化体系的建立为研究BBTVRep蛋白的结晶奠定了基础,也为今后ABTV、FBNYV、MVDV、PNYDV等病毒的相关复制蛋白纯化提供了重要数据。

蛋白质相互作用技术在热带植物病毒研究中的应用

蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction)承载着生物体生命活动的各个过程,研究热带植物病毒中的蛋白质-蛋白质相互作用,不仅可以从分子水平揭示病毒蛋白质的功能,还可以揭示病毒在寄主细胞中的侵染机理,从而制定相关策略预防病毒的突然爆发或进行疾病治疗。而蛋白质相互作用研究方法已有50多年的历史,如早期的化学交联法;并且该方法的技术在不断地完善和更新,产生了一序列新的技术,包括酵母双杂交、GST pull-down,免疫共沉淀和串联亲和纯化等多种技术。由于本实验室在热带植物病毒研究中涉及了多种蛋白质相互作用技术,为此,本文总结热带植物病毒研究中常用的蛋白质相互作用技术。

柑桔黄龙病菌亚洲种菌毛形成蛋白基因序列分析、原核表达及抗血清制备

柑桔黄龙病菌菌毛形成蛋白(pilus formation protein, 408)是一种丰度较高的分泌蛋白。以感染柑桔黄龙病(HLB)的海南琼海市绿橙叶片为材料提取总DNA,利用408基因的特异引物进行PCR扩增,获得该基因的目的片段。序列分析结果表明海南琼海黄龙病菌408基因与柑桔黄龙病菌亚洲种psy62株系 (GenBank登录号:CP001677.5)408基因序列一致。功能预测结果表明其含有一个与菌毛形成相关的N端结构域,以及C端含有两个高度保守的基序(Motif 1和Motif 2)。通过Eco R Ⅴ和Xho Ⅰ双酶切构建重组载体p ET32a-408并将其转化BL21(DE3)大肠杆菌。重组菌经终浓度为1 mmoL/L IPTG诱导,目的蛋白主要以包涵体形式表达。目的蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化,并以此为抗原,腹腔免疫小白鼠,获得效价在1∶500～1∶10000的多克隆抗血清;Western blot进一步分析表明,408蛋白多克隆抗血清特异性强。研究结果为柑桔黄龙病菌408蛋白功能研究和柑桔黄龙病菌的蛋白检测产品开发提供重要科学依据。

诺丽花叶病及其病原鉴定

主要介绍了近年来诺丽植株严重花叶病的发病特征、病毒病原鉴定方法、昆虫传播媒介,并提出相应的防控建议与措施,为有关政府部门和种植户提供重要科学信息。

诺丽花叶病毒首次被鉴定

2015年以来,在中国云南省西双版纳的诺丽种植园发生严重的病毒性病害,给该地区的种植户带来了严重的经济损失。感染病毒的诺丽叶片呈典型的花叶病,叶片上有淡绿色和深绿色的斑块。为了明确该病毒病原及其特征,中国热带农业科学院热带生物技术研究所与云南热带作物科学研究所研究人员开展合作,通过透射电镜发现该病毒粒子呈线状,粒子大小与马铃薯Y病毒属相符.

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高粱花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验。采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA。经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒。经检测构建的文库容量为1.6×106cfu,文库滴度2.2×106cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96%。结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础。

槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备

根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因(Ac Pmp)序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP,以病样槟榔总DNA为模板扩增该Ac Pmp的编码区并连接到p MD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒p MD19T-Ac Pmp,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收Ac Pmp片段,然后以正确的编码框连接到原核表达载体p ET32a(+),转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有p ET32a-Ac Pmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,在30℃,0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h,可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔,取其抗血清,以融合蛋白(1∶10 000稀释)作抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。

海南菠萝几种叶部真菌病害研究

对海南5个菠萝产区菠萝叶部真菌病害进行了调查研究。结果表明,共有6种真菌病害发生较普遍,危害较重,分别由胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、画眉草弯孢菌Curvularia eragrostidis、刺环裂壳孢菌Annellolacinia dinemasporioides、掌状拟盘多毛孢菌Pestalotiopsis palmarum、喙状凸脐蠕孢菌Exserohilum rostratum和金色毛壳菌Chaetomium aureum引起,其中喙状凸脐蠕孢菌E.rostratum和金色毛壳菌C.aureum为我国首次报道。本文同时对6种病害的发病症状和病原形态进行了初步描述。

甜椒脉斑驳病毒(PVMV)在海南的发现与检测

2014年在海南辣椒病毒病调查过程中发现了一种疑似病毒感染的辣椒样品,主要表现为叶片黄化、绿斑驳、叶脆易折断,且在田间发生较多。利用马铃薯Y病毒属的简并引物对其叶片总RNA进行RT-PCR检测,并将约1 700 bp目的片段克隆到p MD18-T载体上进行测序和BLAST分析。结果表明:该条带序列(包含部分NIb和部分cp基因)与已收录的甜椒脉斑驳病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)(Gen Bank登录号:FM202327)序列相似性最高,达99%。设计cp基因的特异引物,对上述样品进行cp基因扩增并构建以cp基因序列为基础的系统进化树,发现海南辣椒上的PVMV与台湾的PVMV分离物ns1株同源性最高。田间检测结果表明:海南黄灯笼辣椒上PVMV的检出率高达74.07%,说明PVMV可能成为海南辣椒生产上的潜在威胁。

木薯eIF4E7基因RNAi载体构建及沉默效果分析

由木薯褐色条斑病毒(Cassava brown steak virus,CBSV)和乌干达木薯褐色条斑病毒(Uganda Cassava brown steak virus,UCBSV)引起的木薯褐色条斑病毒病(CBSD)严重威胁着非洲木薯种植业的发展,且目前没有十分有效的防治方法。病毒侵染植物需要借助植物的翻译和复制系统来完成基因组的翻译及自身的复制,其中真核翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E,e IF4E)是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。e IF4E7是木薯编码的e IF4E基因家族成员之一,本研究构建该靶标基因的RNAi表达载体p1300-Ca4E7。本生烟瞬时表达系统结合半定量RT-PCR的方法证明,该载体能高效沉默过量表达载体p AI-Ca4E7中的e IF4E7基因在本生烟叶片中的表达。研究结果为进一步研究木薯e IF4E7在CBSV及UCBSV侵染中的作用以及利用RNA技术干扰植物基因的病毒防治新策略奠定基础。

海南万宁产区菠萝凋萎病(MWP)田间发生情况调研初报

从生育期、果园土质类型和季节等3个方面分析了海南万宁产区菠萝凋萎病(MWP)田间发生概况,提出了相关防控措施建议。结果显示,万宁产区MWP平均显症率在30%左右,总体呈现速生期<返青期<催花期<花期<小果期<大果期<采后育苗期、壤土园<砂壤土园<沙土园、夏季<秋季<冬春季的特点。综合而言,万宁产区MWP发生程度是种苗、生长发育阶段、土质、季节和水肥等因子综合作用的结果。

海南琼海地区菠萝凋萎病田间发生情况调查

为掌握海南琼海地区菠萝凋萎病(Mealybug Wilt Disease of Pineapple,MWP)发生概况的基础数据,基于2018年以来琼海菠萝主产乡镇MWP田间显症率数据,从菠萝生育期、果园土壤类型和季节3方面分析了MWP田间发生特点。结果显示,MWP总体显症率约30%;全生育期MWP显症率呈现先高后低再渐升的趋势,即育苗期>大果期>小果期>花期>催花期>返青期>速生期;从果园土壤类型来看,MWP显症率沙土>砂壤土>壤土;从季节上看,MWP显症率呈夏季<秋季<冬春季的特点,水肥管理水平较高的果园显症率较管理不到位的低,且存在带毒种苗在产区间调运传播可能。琼海地区MWP发生程度是种苗、生育期、土壤、季节和管理等因子综合作用的结果,而非单一因子决定,鉴于此提出相关防控措施建议。

花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建

初步分析植原体免疫膜蛋白的结构,以Imp构建诱饵质粒,为研究植原体与寄主互作的分子机理,探讨植原体传播、侵染及在寄主内的运输方式奠定基础。根据本实验室获得的花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因序列设计特异性引物Imp-F/Imp-R,通过PCR扩增获得花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因,大小519 bp,编码蛋白含有172个氨基酸残基,与SPWB膜蛋白的核苷酸差异一个碱基,氨基酸序列相同。另外与WBDL膜蛋白的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为79.8%和70.2%。对其进行系统发育树分析;初步分析imp基因编码蛋白的跨膜区和疏水区。分析结果表明:花生丛枝植原体免疫膜蛋白C端有一跨膜锚定区,N端主要为膜内亲水区,没有前导信号序列。预测花生丛枝植原体免疫膜蛋白是一类C端跨膜的植原体免疫膜蛋白。将imp基因克隆到带有λcI基因的pBT质粒上,构建诱饵载体pBT-Imp,并通过IPTG诱导表达,western blot检测和自激活检验对其进行检测。结果显示:所构建的诱饵载体pBT-Imp可用于细菌双杂交的进一步实验。