猪肺炎支原体P46-P65重组蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立猪肺炎支原体(Mhp)血清学调查及免疫评估方法,本研究利用DNAStar生物学软件对Mhp的P46和P65进行抗原表位分析,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)获得P46-P65融合基因,构建重组表达质粒pETP46-P65,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导后获得了可溶性表达的重组P46(aa33~aa419)-P65(aa307~aa627)蛋白(rP46-P65)。以纯化的r P46-P65为包被抗原,经优化各反应条件后建立了检测Mhp抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示所建立的方法与CSFV、FMDV、PEDV、PCV2、PRV、PRRSV和APP等阳性血清均无交叉反应。该方法可检测到最高稀释至6 400倍的Mhp阳性血清,批内和批间变异系数均小于5%。利用IDEXX试剂盒和本研究建立的方法同时检测298份临床血清样品,前者的检测阳性率为62.4%(186/298),后者的检测阳性率为73.8%(220/298),两者检测结果的总符合率为88.6%。IDEXX检测为阳性的血清,采用本研究建立的ELISA方法检测也均为阳性;而部分Mhp阳性猪经IDEXX试剂盒检测为阴性的血清,该ELISA方法检测结果却为阳性,其中79.4%(27/34)检测结果有差异的血清经Mhp颜色变化试验证明均为阳性,表明本研究建立的ELISA方法的敏感性明显高于IDEXX方法。本研究建立的检测猪Mhp抗体的间接ELISA方法与目前广泛使用的方法相比优势明显,为临床血清流行病学调查及血清抗体水平评估提供了可行方法。

“饲料禁抗”后规模猪场猪传染性胸膜肺炎的血清学调查和分析

为了解“饲料禁抗”后规模猪场中猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)的流行情况,本试验于2021―2023年在16个未免疫疫苗的APP阳性规模猪场采集不同生产阶段猪群的2286份血清样本,应用间接ELISA进行抗体检测。结果显示:(1)16个规模猪场血清样本的APP抗体总阳性率为61.2%(1399/2286),高于文献报道的“饲料禁抗”前猪群阳性率(20%~53%);(2)在不同生产阶段的猪群中,母猪APP抗体阳性率最高(92.4%,545/590),其次为哺乳期仔猪(87.6%,227/259),而后从高到低依次是育肥后期、保育期和育肥中期猪群,APP抗体阳性率分别为63.6%(361/568)、43.7%(129/295)和35.3%(122/346),育肥早期猪群的APP抗体阳性率最低,为6.6%(15/228);(3)初产母猪的APP抗体阳性率(73.8%)明显低于其他胎次母猪(96.3%~97.4%);(4)猪只的APP母源抗体随着日龄的增长而下降,基本在90日龄时降到最低,此后猪群因APP感染而导致APP抗体水平和阳性率均开始缓慢上升,到肥猪出栏前仍一直上升。结果表明,饲养密度增加和推迟肥猪出栏是导致规模猪场APP感染大幅上升的重要因素。

引起新生仔猪腹泻的肺炎克雷伯菌的分离鉴定及药敏试验

2021年4月中旬,实验室从岳阳某猪场严重腹泻死亡的新生仔猪肠系膜淋巴结中,分离得到在麦康凯琼脂培养基上生长为红色菌落、革兰氏染色为红色短杆状的细菌,通过16S r RNA和质谱鉴定该菌为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示,该菌对左氧氟沙星敏感,对大观霉素和多西环素较敏感。针对药敏试验结果对猪场腹泻仔猪用药后,腹泻情况明显好转,进一步说明引起腹泻的病原为肺炎克雷伯菌。

中年段语文找准读写结合切入点的策略研究

小学中年段语文教学,读写结合是提升学生语文素养的关键。本文以小学语文人教版(统编版)教材为研究对象,探讨了找准读写结合切入点的策略。分析了当前小学中年段语文教学读写结合的现状,指出了存在的问题,如学生阅读兴趣不高、写作能力欠缺等。提出了一系列针对性的策略,包括激发学生阅读兴趣、优化教学方法、加强写作训练等。通过案例分析,展示了这些策略在实际教学中的应用效果。对未来小学中年段语文教学的发展趋势进行了展望,强调了持续创新教学方法的重要性。本研究旨在为小学语文教师提供实用的教学策略,以促进学生语文能力的全面发展。

中医舌诊自动识别方法的研究

本文分析了中医舌诊的主要内容，提出了实现自动识别的对策。在此基础上，以Ｍｕｎｓｅｌｌ颜色系统为色标，运用色度学、近代光学技术、数字图像处理技术和计算机硬件技术，建立了中医舌诊自动识别系统。在该系统上，以中医辨症论治学说为指导，将计算机软件技术与临床辨舌经验结合，利用样本训练系统，根据模糊数学理论，确定有关舌像的定义域，进行纹理分析。临床研究了３６６例淡红舌、暗红舌、紫红舌、暗紫舌四种舌像，符合率８６．３４％。

以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法的研究

以在Ｅ．ｃｏｌｉ高效表达的猪瘟病毒Ｅ２基因主要抗原编码区（ｍＥ２）为抗原，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的兔抗猪ＩｇＧ为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。经检测筛选出最佳反应条件为：１２μｇ／孔纯化的Ｅ．ｃｏｌｉ表达的ｍＥ２重组蛋白包被酶标板，用１０％的兔血清或马血清进行封闭，以正常Ｅ．ｃｏｌｉ裂解上清液稀释待检血清。试验表明应用重组ｍＥ２蛋白作为诊断ＨＣＶ抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

猪瘟病毒兔化弱毒(HCLV)疫苗株基因组全长cDNA的克隆与序列分析

根据猪瘟病毒基因组的序列设计合成了覆盖HCLV基因组全部序列的5对引物,通过RT-PCR从感染家兔脾脏中扩增获得了包含HCLV(bog cholera lapinized virus,HCLV)基因组全序列的5个cDNA片段,并将它们分别克隆至pGEM-T vector中。然后将这5个cDNA片段按它们在HCLV基因组上的位置从5’端至3’端的顺序依次通过酶切连接,一并克隆到pPoly2载体中得到HCLV基因组全长cDNA的质粒pPOHCLV。序列分析表明,HCLV基因组长度共12310bp,有一个大的ORF,编码一3898个氨基酸的多聚蛋白。其5'-NCR和3’-NCR长度分别是374nt和239nt。与非兔化毒株相比较,HCLV基因组在12133nt处有12个碱基的插入CTTTTTTCTTTT,该序列可能是病毒在适应兔体增殖过程中形成的。基于基因组全序列及其所推导的氨基酸序列的同源性分析表明,毒株的亲缘关系的远近与它们的毒力之间并没有相关性。

基于SPR传感的空间相位调制蛋白质芯片检测方法

无标记蛋白质芯片检测可成为蛋白质组学研究的重要技术平台。将空间相位调制与SPR传感结合,使发生SPR时引起的反射光的相位变化转化为干涉条纹的位置变化,通过分析干涉条纹的位置变化即可获得反射光的相位变化,从而解析出相关生物信息。在构建了空间调制SPR相位检测实验装置的基础上,进行了生理盐水浓度测定以及兔IgG和羊抗兔IgG相互作用检测实验。实验结果表明,NaCl溶液分辨率至少为3×10-5RIU,检测的动态范围达到1.33～1.37,兔IgG与羊抗兔IgG相互作用时引起相位变化12°。这些实验结果表明,该方法适合蛋白质微芯片的检测。

猪瘟病毒E2基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

构建了猪瘟病毒 (classicalswinefevervirus,CSFV)主要保护性抗原E2基因 4种不同的真核表达质粒。小鼠免疫试验表明 ,E2基因上不同的功能区对基因疫苗的免疫应答有很大影响 ,有信号肽序列的E2基因可诱导产生特异性免疫反应 ,且无跨膜区序列的E2基因所诱导的免疫应答反应比有跨膜区序列的强 ,而无信号肽序列的E2基因则不能诱导产生CSFV特异性的免疫反应。攻毒保护试验表明 ,免疫家兔最少可抵抗 10个最小感染剂量 (MID)的猪瘟兔化弱毒苗 (Hogcholeralap inizedvirus,HCLV)的攻击 ;免疫猪可抵抗致死剂量的CSFV石门株强毒的攻击。

猪IL-6 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用 RT- PCR方法 ,从经刀豆球蛋白 A(Con A)诱导的猪外周血单核细胞 (PMBCs)总 RNA中扩增得到了猪 IL -6 (porcine IL- 6 ,p IL- 6 )的 c DNA,并将其克隆到 p GEM- T载体上。DNA序列测定表明 ,克隆得到的 p IL- 6 c DNA与国外报道的完全一致 ,包括终止密码子在内其编码区的长度为 6 39bp,编码 2 12个氨基酸残基的蛋白质。将 p IL - 6成熟肽段编码区亚克隆至 p ET- 2 8(a)中 ,构建成原核表达质粒 p ETPIL6。该质粒的 BL2 1(DE3) L ys S转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达 p IL- 6 ,表达量占菌体总蛋白的 30 .6 0 %～ 38.35 %。

中医舌诊自动识别系统

本文叙述了中医舌诊自动识别系统的组成、工作过程和真彩色图像处理电路。提出了把样本训练技术与模糊聚类方法相结合,建立计算机判别标准,实现舌像的自动识别。本文还叙了系统软件设计及特点。临床实验表明,专家辨舌与自动辨舌比较,舌质符合率89.24％,舌苔符合率94.20％,结果令人满意。

蛋白质微阵列SPR实时相位检测

将表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,SPR)与空间相位调制检测结合,用一束准直的平行光照射传感芯片,在反射光路中引入渥拉斯顿棱镜,使光束中的p光和s光产生偏振光干涉形成条纹,生化反应的有关信息从干涉条纹的相位变化中得出.选择金膜厚度为30nm和40nm的两种芯片,分别用浓度为50%和20%的酒精-水溶液进行实验,得到SPR阵列图谱;选择金膜厚度为30nm,兔IgG作为阳性对照,牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照,与0.2mL的羊抗兔IgG、1.8mL水的混合溶液反应,得到阵列反应图谱.实验结果表明,这种方法具有抗干扰能力强,灵敏度高,无需标记和可实时检测等优点,能满足蛋白质芯片检测的要求.

T7 RNA多聚酶基因的克隆、序列测定及其在E.coli中的表达

从 BL 2 1(DE3) E.coli菌株中以 PCR的方法扩增得到了与 T7RNA多聚酶 (T7RNA polymerase,T7pol)基因大小一致的 DNA片断。将 PCR产物纯化后直接克隆到 p GEM- T载体中 ,经酶切鉴定和 DNA序列分析表明克隆得到了正确的 T7pol基因。将 T7pol基因亚克隆入 p ET- 2 8b(+)中 ,构建得到原核表达质粒 p ET2 8T7。该质粒的 BL 2 1(DE3) p L ys S转化菌在 IPTG的诱导下可表达约 9880 0的蛋白 ,这与 T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5 α、JM10 9、HB10 1、BL2 1(DE3)和 BL2 1(DE3) p L ys S等 5种不同的宿主菌 ,仅有转化 T7pol酶活性受到抑制的宿主菌 BL2 1(DE3) p L ys S才能得到转化子 ,而其余 4种 T7T7pol酶活性不受抑制的 E.coli宿主菌不能得到转化子。p ET2 8T7原核表达质粒这种仅能在 T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的 T7pol基因能正确表达出具有

横向塞曼激光器在生物分子检测中的应用研究

首先简述了表面等离子体共振原理、激发表面等离子体共振的条件和产生共振时反射光的相位变化 ,再对横向塞曼激光器的应用进行了分析。接着 ,基于相位检测 ,以横向塞曼激光器为光源 ,建立了生物分子相互作用检测实验装置 ,并以蓖麻毒素和羊抗小鼠抗体为样本进行了实验。实验表明 :检测灵敏度高 ;在整个光路中 ,P光与S光完全重合 ,满足共光路原则 ,对空气折射率和其它各种扰动具有很好的自适应性 ,检测稳定性好 ;激光稳频精度可达 3.5× 10 - 10 ,与光强检测法相比 ,检测可靠性更高。

基于SPR相位检测的蛋白质芯片信号获取与处理研究

表面等离子体共振传感器有可能发展成为一种灵敏的高通量检测的蛋白质组学研究工具,而信号获取和数据处理是其关键之一。本文利用数值模拟全面研究了微阵列相位检测的分辨率与空间采样频率、采样周期数以及ADC位数等关系,详细分析了相关、正弦拟合和傅立叶变换(FTP)等算法对相位检测的精度和误差等影响。研究结果表明,在理想状况下,4个CCD像素就能满足分辨率对光电转换的要求,而在有噪音的情况下,分辨率随着空间采样频率的增加而提高;信号周期数对分辨率影响不大,但有利于克服噪声影响,提高精度;ADC对分辨率影响最大,高分辨率需要选择多位ADC,8位ADC时分辨率约为0.15°,10位时约为0.05°,而12位时约为0.01°。

用于将DNA疫苗在体导入表皮细胞的微弹加速技术

分析了将裹着DNA疫苗的微弹射入表皮细胞技术的现状 ,提出了基于两阶段引射器加速微弹的方法 ,进行了数值模拟 ,得到了不同工况下第二级喷嘴的马赫数等值线、出口截面上的静压、轴线上的速度以及在负压孔产生的负压等分布。在此基础上 ,进行了实验研究 ,测得了外流场的压力、微弹速度和负压孔的负压值。同时 ,还观察了钨微弹的实际分布 ,并以钨粉为微弹射击鸡皮。结果表明 ,模拟数据与测量结果一致性好 ,数值模拟可以指导仪器设计和实际操作 ;微弹分布均匀 ,能射入表皮细胞 ,还可穿透表皮 。

基于SPR原理的生物分子相互作用光强法检测技术

本文简述了表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,简称SPR)原理、激发表面等离子体共振的条件和共振发生时反射光的光强变化，对角度扫描法和波长扫描法进行了分析。接着，基于角度扫描的光强检测，以半导体激光器为光源，建立了生物分子相互作用检测实验装置，并在模拟分析的基础上以蓖麻毒素与其单克隆抗体为样本进行了实验。实验表明，实验系统结构简单，可以实时监测生物分子间的相互作用过程，对样本无需进行标记，操作简便。

纳米生物学的研究进展及其应用前景

纳米生物学是在纳米科技问世后出现的，是纳米科技的重要组成部分。本文简述了纳米生物学的研究内容，详细叙述了纳米生物学的研究进展，同时还展望了纳米生物学的应用前景。

用于单个生物分子分析的纳米操作和纳米测量技术

本文叙述了用于单个生物分子分析的纳米操作和纳米测量技术。光镊子能镊住大分子，按照测量要求进行操作。近场光学扫描显微术是结构生物学的重要研究手段，可以测量大分子的结构。分子马达力学特性测量技术的出现是分子马达研究的新突破，能测出单个分子马达的力学参数。