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桔梗PgHMGS和PgHMGR基因克隆与原核表达分析
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作者 余函纹 刘梦丽 +4 位作者 李景 彭华胜 韩邦兴 查良平 桂双英 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期3062-3068,共7页
目的从桔梗植物的根中克隆羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因,并进行生物信息学及原核表达分析。方法依据桔梗转录组数据中筛选的基因序列信息,通过RT-PCR从桔梗根中克隆得到桔梗PgHMGS和PgHMGR基... 目的从桔梗植物的根中克隆羟甲基戊二酰辅酶A合酶(HMGS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因,并进行生物信息学及原核表达分析。方法依据桔梗转录组数据中筛选的基因序列信息,通过RT-PCR从桔梗根中克隆得到桔梗PgHMGS和PgHMGR基因;通过生物信息学分析软件预测PgHMGS和PgHMGR的蛋白性质,构建蛋白的三级结构模型,进行系统进化分析;构建重组表达载体pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR,在Ecoli.BL21(DE3)中诱导表达。结果克隆获得的PgHMGS、PgHMGR ORF长度分别为1401、1749 bp,分别编码466、582个氨基酸。通过在线软件预测PgHMGS、PgHMGR分别定位于线粒体膜和内质网,均为酸性蛋白。二级结构预测结果显示PgHMGS、PgHMGR主要由α-螺旋组成。跨膜结构域预测PgHMGS不包含跨膜结构域,PgHMGR在54~76、96~118 aa分别有两个跨膜结构域。结构功能域分析PgHMGS的4~466 aa具有PLN02577(羟甲基戊二酰辅酶A合酶)家族的保守结构域,PgHMGR的171~574 aa具有HMG-CoA_reductase_classI(HMG-CoA还原酶)的保守结构域。SDS-PAGE结果显示PgHMGS和PgHMGR基因成功在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白分子量分别为45、70 kDA,与预测结果一致。结论本研究首次克隆桔梗HMGS和HMGR基因(命名为PgHMGS和PgHMGR),并成功诱导出重组蛋白,为进一步研究桔梗三萜生物合成途径奠定基础。 展开更多
关键词 桔梗 HMGS HMGR 基因克隆 原核表达
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桔梗中PgMCT和PgCMK的克隆及原核表达分析 被引量:1
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作者 刘梦丽 余函纹 +5 位作者 李景 徐睿 吴君贤 彭华胜 查良平 桂双英 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期1600-1605,共6页
目的从桔梗中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)和4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤藓糖醇激酶(CMK)基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学及原核表达分析。方法根据桔梗转录组数据,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到PgMC... 目的从桔梗中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)和4-(5’-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤藓糖醇激酶(CMK)基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学及原核表达分析。方法根据桔梗转录组数据,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到PgMCT和PgCMK序列,利用生物信息学软件预测PgMCT和PgCMK蛋白的特征;利用ClustalW和MEGA 6.06软件构建PgMCT和PgCMK的系统进化树;构建原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。结果PgMCT和PgCMK基因ORF全长为954、1227 bp,分别编码317、408个氨基酸,均为不稳定蛋白。PgMCT和PgCMK蛋白的二级结构中,均为无规卷曲所占比例最高。结构功能域分析PgMCT和PgCMK分别属于糖基转移酶GT-A超家族和IspE超家族,推测这2个蛋白均为非跨膜蛋白。预测PgMCT和PgCMK蛋白均无跨膜结构,为非跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,PgMCT和PgCMK诱导表达蛋白分别为55、50 kDa,与预期蛋白分子量一致。结论本实验首次从桔梗中克隆出MCT和CMK(命名为PgMCT和PgCMK),为进一步探究桔梗三萜皂苷成分的生物合成奠定了物质基础。 展开更多
关键词 桔梗 MCT CMK 基因克隆 原核表达
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桔梗DXS基因的原核表达、亚细胞定位和酶活性分析
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作者 董楠 余函纹 +6 位作者 刘梦丽 李景 陈博文 常相伟 王举涛 查良平 桂双英 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1059-1068,共10页
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase,DXS)是甲基赤藓醇磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径中催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)的第一个关键酶。本研究通过反... 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatesynthase,DXS)是甲基赤藓醇磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径中催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)的第一个关键酶。本研究通过反转录·聚合酶链反应(RT-PCR)从桔梗根中克隆得到PgDXS1、PgDXS2、PgDXS3基因,开放阅读框(ORF)全长分别为2160、2208和2151 bp,分别编码719、735、716个氨基酸,同源氨基酸序列分析表明桔梗与橡胶树、曼陀罗及甜菊的DXS基因编码的氨基酸序列具有较高同源性;进一步构建原核表达载体pET-28a-PgDXSs,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功诱导3个DXS蛋白的表达。亚细胞定位结果显示,PgDXS1和PgDXS2蛋白主要定位于叶绿体中,PgDXS3蛋白定位于叶绿体、细胞核和细胞质中。运用实时荧光定量PCR检测3个DXS基因在2个产区不同组织中的表达水平,结果表明3个DXS基因均在太和桔梗叶中高表达。在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理下,PgDXS1、PgDXS2、PgDXS3基因表达水平在不同诱导的时间点(3~48 h)呈现先降低后增高的趋势;酶活性检测结果显示:桔梗的3个组织中DXS酶活性在MeJA处理后不同的时间点也呈现先增加后降低的趋势。本研究为进一步阐明桔梗中萜类化合物合成途径PgDXS基因的生物学功能提供参考。 展开更多
关键词 桔梗 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 基因克隆 原核表达 亚细胞定位 酶活性分析
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茅苍术硫解酶AIKAT基因的克隆及原核表达分析 被引量:5
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作者 徐睿 单婷玉 +4 位作者 吴君贤 刘梦丽 余函纹 查良平 彭华胜 《中国中药杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第19期4950-4958,共9页
对茅苍术脂肪酸β-氧化途径中关键酶3-酮脂酰-CoA硫解酶(KAT)基因进行克隆并开展生物信息学分析、原核表达和基因表达分析,为研究茅苍术脂肪酸β-氧化机制奠定基础。根据茅苍术转录组数据中KAT基因序列信息,设计特异性引物,采用RT-PCR... 对茅苍术脂肪酸β-氧化途径中关键酶3-酮脂酰-CoA硫解酶(KAT)基因进行克隆并开展生物信息学分析、原核表达和基因表达分析,为研究茅苍术脂肪酸β-氧化机制奠定基础。根据茅苍术转录组数据中KAT基因序列信息,设计特异性引物,采用RT-PCR方法克隆获得茅苍术3-酮脂酰-CoA硫解酶基因全长序列,命名为AIKAT(GenBank登录号为MW665111)。结果分析表明,AIKAT基因的开放阅读框(ORF)为1 323 bp,编码440个氨基酸,推测其相对分子质量为46 344.36,蛋白理论等电点为8.92。通过在线工具预测AIKAT为稳定的碱性蛋白,跨膜结构域分析表明AIKAT无跨膜结构,二级结构显示其主要由α-螺旋结构组成,利用同源建模进行三级结构预测;同源氨基酸序列分析表明茅苍术与黄花蒿、洋蓟、地黄、拟南芥KAT编码的氨基酸序列具有较高的同源性;系统进化树分析显示AIKAT与洋蓟CcKAT2聚为一支,证实了菊科3-酮脂酰-CoA硫解酶基因的同源性;构建原核表达载体pET-32a-AIKAT并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)表达感受态进行诱导表达,在64 kDa处成功表达出目的蛋白;利用实时荧光定量PCR技术检测了茅苍术3个组织中的AIKAT基因表达量,结果显示AIKAT在根状茎中表达量最高,其次是叶、茎。该研究首次克隆得到AIKAT基因,使其重组蛋白在大肠杆菌中成功表达,并验证了其在不同组织中存在差异表达,为进一步研究茅苍术脂肪酸β-氧化途径奠定了基础。 展开更多
关键词 茅苍术 3-酮脂酰-CoA硫解酶 基因克隆 原核表达 表达分析
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天麻中糖基转移酶基因GeGT1的克隆及原核表达分析 被引量:2
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作者 刘梦丽 余函纹 +5 位作者 单婷玉 吴君贤 彭华胜 程铭恩 查良平 桂双英 《中草药》 CAS CSCD 北大核心 2021年第14期4327-4333,共7页
目的克隆天麻糖基转移酶基因(glycosyltransferase,Ge GT1)的全长cDNA序列,进行序列分析和原核表达分析,并探究该基因在天麻不同器官中的表达规律。方法在天麻转录组数据库中通过注释和比对,用PrimerPremier5.0软件设计基因特异性引物... 目的克隆天麻糖基转移酶基因(glycosyltransferase,Ge GT1)的全长cDNA序列,进行序列分析和原核表达分析,并探究该基因在天麻不同器官中的表达规律。方法在天麻转录组数据库中通过注释和比对,用PrimerPremier5.0软件设计基因特异性引物。通过反转录聚合酶链式扩增(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法从天麻块茎中克隆得到Ge GT1全长cDNA序列,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的特征;利用Clustal W和MEGA6.06软件构建GeGT1的系统进化树;构建原核表达载体pET-28a-GeGT1,转化至大肠杆菌Transetta(DE3)进行诱导表达;通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术分析基因表达模式。结果Ge GT1基因开放阅读框(open reading frame,ORF)全长1503 bp,编码500个氨基酸,蛋白相对分子质量为55494.33,理论等电点为5.51,为稳定的酸性蛋白。襄襆襈襌襐襒襔襠襢襦襨襶襼覊覌覚覜覦覨覮覰覸覺覼覾览觊角觔觜膜结构域,无信号肽,为非分泌蛋白。通过序列同源性分析,GeGT1与铁皮石斛具有较高的同源性。系统进化树分析证实了兰科植物糖基转移酶基因的同源性。SDS-PAGE结果显示,诱导表达蛋白为63000,与预期蛋白大小一致。基因表达结果显示,Ge GT1基因的表达水平在花中最高,其次是块茎、茎。结论首次克隆并分析了Ge GT1基因,建立了原核表达体系,为进一步研究天麻活性成分合成的分子机制奠定基础。 展开更多
关键词 天麻 糖基转移酶 基因克隆 序列分析 原核表达 实时荧光定量PCR
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山楂果实转录组分析及三萜合成关键酶基因SQE的克隆与生信分析 被引量:1
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作者 吴君贤 徐睿 +5 位作者 尹旻臻 李景 余函纹 刘梦丽 彭华胜 查良平 《药学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期3313-3324,共12页
山楂为我国传统中药,含有机酸和三萜酸类等活性成分,具有重要的药用和食用价值。为研究山楂不同发育时期的基因表达差异并挖掘山楂有效成分生物合成的基因,本研究利用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术对同一产地不同发育时期的山楂果... 山楂为我国传统中药,含有机酸和三萜酸类等活性成分,具有重要的药用和食用价值。为研究山楂不同发育时期的基因表达差异并挖掘山楂有效成分生物合成的基因,本研究利用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术对同一产地不同发育时期的山楂果实进行转录组测序和生物信息学分析。经Trinity软件组装后获得78496条Unigenes,平均长度为941 nt,其中58395条Unigenes能被NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO等公共数据库注释。对注释得到的Unigenes进行KEGG代谢通路分析,有52条Unigenes编码15个关键酶参与柠檬酸循环,有62条Unigenes参与山楂的三萜合成通路。同时,本研究克隆获得了2个鲨烯环氧酶基因CpSQE1、CpSQE2并进行了生物信息学分析,结果表明CpSQE1和CpSQE2 ORF全长分别为1594 bp、1597 bp,分别编码530、531个氨基酸,蛋白质分子质量为57.6 kDa、57.5 kDa,生物信息学分析表明CpSQE1和CpSQE2蛋白保守区都含有一个PLN02985superfamily保守结构域,均属于鲨烯单加氧酶超家族,系统进化树显示CpSQE1、CpSQE2均与其他植物中具有鲨烯环氧酶功能的SQE聚为一支。该研究为进一步挖掘山楂有效成分生物合成过程中的关键基因,解析调控其有效成分生物合成途径提供研究基础。 展开更多
关键词 山楂 不同时期 有效成分 基因表达
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桔梗萜类合成途径PgMCS和PgHDR基因克隆与原核表达分析 被引量:1
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作者 李景 刘梦丽 +5 位作者 余函纹 周卓 常相伟 王举涛 查良平 桂双英 《植物生理学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期533-542,共10页
为了研究桔梗三萜类化合物生物合成途径中的关键酶,根据桔梗转录组数据中的基因序列信息,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到了2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS)和1-羟基... 为了研究桔梗三萜类化合物生物合成途径中的关键酶,根据桔梗转录组数据中的基因序列信息,通过RT-PCR方法从桔梗根中克隆得到了2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS)和1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]基因PgMCS和PgHDR,进行序列分析和原核表达分析。结果表明PgMCS和PgHDR的开放阅读框(ORF)长度分别为738和1416 bp,分别编码245和471个氨基酸,相对分子质量分别为26277.53和52984.17;PgMCS和PgHDR蛋白理论等电点分别为7.71和5.92。PgMCS具有PLN02862(MECDP合酶)家族的保守结构域,PgHDR具有PLN02821(HMBPP还原酶)家族的保守结构域。原核表达结果显示,IPTG均可成功诱导目的蛋白表达,分子质量分别为26和60 kDa。基因表达结果显示,PgMCS和PgHDR基因的表达水平在叶中最高,其次是茎和根。本文首次克隆并分析了桔梗PgMCS和PgHDR基因,成功建立原核表达体系,为进一步研究桔梗三萜类化合物生物合成的分子机制提供理论依据。 展开更多
关键词 桔梗 MCS HDR 基因克隆 原核表达
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Metabolomics of ginger based on ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry technology
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作者 严辉 邹冬倩 +6 位作者 周桂生 余函纹 李鹏辉 王天舒 包贝华 郭盛 段金廒 《Food Quality and Safety》 SCIE CSCD 2021年第2期170-178,共9页
Objectives:Dried ginger and ginger are the same type of medicine and food.The differential components of ginger and dried ginger,dried ginger and ginger charcoal were investigated.Materials and Methods:The experimenta... Objectives:Dried ginger and ginger are the same type of medicine and food.The differential components of ginger and dried ginger,dried ginger and ginger charcoal were investigated.Materials and Methods:The experimental materials were divided into three sample groups:the ginger group,dried ginger group,and ginger charcoal group.The ginger group,dried ginger group,and ginger charcoal group were qualitatively analyzed by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry.The data were processed by Marker View Software.Principal component analysis and orthogonal partial least-square discriminant analysis were performed with SIMCA 13.0 Software.The differential components of the ginger and dried ginger groups as well as the dried ginger and ginger charcoal groups with a variable importance in the projection>2(P<0.05)were identified with PeakView 1.2 Software.Results:Ten differential components,including 6-gingerol,8-gingerol,and 10-gingerol,were identified between the ginger group and dried ginger group;13 differential components,including 6-shogaol,10-gingerol,and zingiberone,were identified between the dried ginger group and ginger charcoal group.Conclusions:The main differential components between the ginger and dried ginger groups and the dried ginger and ginger charcoal groups were gingerols and diphenylheptanes.Based on metabolomics analysis of the chemical composition of ginger’s medicinal materials,effects,and other related factors,it is recommended that 6-gingerol,6-shogaol,and zingiberone should be used as indicative components for the respective quality evaluation of ginger,dried ginger and ginger charcoal.The results of this study may provide a basis for the reasonable quality evaluation of ginger medicinal materials. 展开更多
关键词 GINGER dried ginger ginger charcoal metabolomics quality evaluation
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