水稻Osε-cop1基因表达模式及功能的初步分析

ε-COP是真核生物中COP I有被小泡的一个亚基,其在植物中的生物学功能还未见报道。本研究对水稻中编码ε-COP亚基的基因进行了生物信息学分析,对其中的Osε-cop1基因进行了时空表达分析,构建了Osε-cop1的RNA干涉载体并转化水稻,对转化植株的表达特性和表型性状进行了分析。生物信息学分析结果表明,编码ε-COP的两个基因有很高的序列一致性,其中的Osε-COP1蛋白与玉米、拟南芥和大豆同源蛋白也具有较高的序列一致性,分别为83%、68%和62%;时空表达分析结果表明,Osε-cop1在穗部特异表达,且在减数分裂期幼穗中表达量最高。RNA干涉的研究结果表明,Osε-cop1的表达下调造成植株穗顶部死亡,暗示该基因对水稻穗的发育具有重要作用。本研究初步揭示了Osε-cop1在水稻中的功能,为进一步研究COPI有被小泡在植物中的功能奠定了基础。

miR-376b-3p可促进Runx2诱导C2C12细胞进行成骨细胞早期分化

背景:转录因子Runx2是调节成骨分化及骨发育的关键因子,过表达Runx2可诱导间质细胞C2C12分化为成骨细胞,但相关诱导分化分子机制并不清楚。目的:分析miR-376家族成员在Runx2诱导C2C12细胞进行成骨分化过程中的作用。方法:利用可诱导表达Runx2的细胞系C2C12/Runx2Dox,在不同的时间点通过荧光定量PCR方法检测miR-376家族成员表达情况。C2C12/Runx2Dox细胞转染miR-376b-3p mimic后利用荧光定量PCR检测成骨细胞标记基因碱性磷酸酶及骨钙素表达情况,并利用碱性磷酸酶染色法分析碱性磷酸酶活性。利用在线工具miRanda,miRWalk与TargetScan共同预测miR-376b-3p潜在靶基因。利用DAVID Bioinformatics Resources数据库对得到的靶基因进行功能聚类分析。结果与结论:在Runx2诱导C2C12进行成骨分化过程中miR-376b-3p表达显著增加,其他成员表达无明显变化。转染miR-376b-3pmimic可上调碱性磷酸酶表达,但对骨钙素表达无影响;转染miR-376b-3pmimic也可增加碱性磷酸酶活性。靶基因功能聚类分析结果表明miR-376b-3p可参与机体骨骼发育过程,表明其在成骨分化过程中的作用。研究结果表明,Runx2通过上调miR-376b-3p的方式对与成骨分化相关基因的表达进行调节,以促进C2C12进行成骨细胞的早期分化。

过表达Runx2促进C2C12细胞成骨分化

利用Tet-on(Tetracycline-on)基因表达系统,通过强力霉素(doxycycline,DOX)诱导Runx2基因在C2C12细胞中的表达,探究Runx2促成骨分化功能,为其分子机制的研究提供一个理想的实验平台.先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-Flag-Runx2转染入C2C12细胞,并用G418和潮霉素分别进行2轮筛选,运用实时荧光定量PCR选择对强力霉素诱导敏感的细胞克隆.用不同浓度DOX诱导C2C12/Tet/pTRE-Flag-Runx2细胞,蛋白免疫印迹检测Runx2的表达,确定DOX的最佳诱导浓度与时间,并检测C2C12细胞的成骨分化能力.结果表明,诱导细胞最佳DOX浓度为10μg/ml;最佳诱导时间为12h;诱导后Runx2基因高表达,C2C12细胞向成骨方向分化(P<0.05).成功建立Tet调控Runx2基因表达C2C12细胞系,为进一步研究Runx2基因功能分子机制提供理想的细胞模型.

Runx2通过抑制细胞巨自噬以诱导C2C12细胞向成骨细胞分化

目的:探讨细胞巨自噬与Runx2诱导C2C12细胞成骨分化的关系。方法:在强力霉素(doxycyc-line,Dox)诱导Runx2表达的细胞系C2C12/Runx2Dox中进行研究。Dox(10 mg/L)处理0 d、1 d、3 d及6 d后,real-time qPCR检测LC3b、Beclin-1、p62和LAMP-2表达情况,Western blotting分析LC3-I/LC3-Ⅱ比值。设置不同的3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或雷帕霉素(rapamycin,Rap)浓度,Dox处理14 d后分析碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性。用3-MA(5 mmol/L)或Rap(10μmol/L)与Dox共同处理1 d、3 d及6 d后检测ALP及骨钙素(osteocalcin,OC)表达情况。结果:(1)C2C12细胞向成骨分化时,LC3b与Beclin-1显著下调,p62与LAMP-2无明显变化;(2)LC3-I向LC3-Ⅱ转换的过程被抑制;(3)3-MA(5 mmol/L)可增强ALP活性,而Rap(10μmol/L)则抑制其活性;(4)3-MA可上调ALP及OC表达,Rap则下调二者表达。结论:Runx2通过下调LC3和Beclin-1、抑制LC3-I向LC3-Ⅱ转换的方式阻碍自噬体形成,以诱导C2C12细胞分化为成骨细胞。